Significado clínico de la expresión de los receptores cannabinoides CB1 y CB2 en lesiones tiroideas humanas malignas y benignas
Resumen
El sistema endocannabinoide está compuesto por los receptores cannabinoides (CB1 y CB2), sus ligandos endógenos (endocannabinoides), y las proteínas responsables de su metabolismo participan en muchas funciones diferentes indispensables para la regulación homeostática en varios tejidos, ejerciendo también efectos antitumorigénicos. El presente estudio tiene como objetivo evaluar la importancia clínica de la expresión de CB1 y CB2 en las lesiones humanas benignas y malignas de la tiroides. La expresión de las proteínas CB1 y CB2 se evaluó inmunohistoquímicamente en tejidos tiroideos embebidos en parafina obtenidos de 87 pacientes con lesiones benignas y malignas y se analizó estadísticamente con los parámetros clinicopatológicos, la capacidad proliferativa de las células foliculares y la tasa de riesgo de recurrencia estimada según el sistema de estadificación de la Asociación Americana de Tiroides (ATA). La expresión aumentada de CB1 y CB2 fue significativamente más frecuente en las lesiones malignas de tiroides que en las benignas ( y , respectivamente). La expresión aumentada de CB1 y CB2 también se observó con mayor frecuencia en los carcinomas papilares en comparación con los nódulos hiperplásicos ( y , respectivamente). En las lesiones malignas de tiroides, la expresión elevada de CB2 se asoció significativamente con la presencia de metástasis en los ganglios linfáticos . También se observó una mayor expresión de CB2 en los casos de tiroides maligno con presencia de invasión capsular , linfática y vascular , así como en aquellos con mayor riesgo de tasa de recidiva , a un nivel no significativo sin embargo, mientras que la expresión de CB1 no se asoció con ninguno de los parámetros clinicopatológicos examinados. Nuestros datos sugieren que los receptores CB pueden estar involucrados en la transformación maligna de la tiroides y especialmente el receptor CB2 podría servir como biomarcador útil y potencial objetivo terapéutico en la neoplasia de tiroides.
1. Introducción
El sistema endocannabinoide (SCE) es un sistema endógeno inductor de señales lipídicas, presente en varios tejidos humanos, que ejerce muchas funciones diferentes y no relacionadas. Numerosos estudios han indicado los efectos reguladores del SCE en el sistema nervioso central y periférico, el tracto gastrointestinal y el sistema inmunitario, estando implicado en múltiples procesos, como la motilidad gastrointestinal, el estado de ánimo, la regulación del dolor, la memoria y el apetito . Estas funciones se desencadenan por la unión de ligandos endógenos y exógenos a los receptores cannabinoides (receptores CB). Además de estas funciones bien conocidas, el ECS también ejerce efectos antiproliferativos a través de la modulación de varias vías de señalización, mientras que su activación puede tener un significado pronóstico para la progresión del desarrollo del tumor.
Existen dos subtipos de receptores CB, con diferente distribución en los tejidos humanos. El receptor CB1 se localiza principalmente en el sistema nervioso central, los adipocitos, el hígado, el páncreas, el músculo esquelético y los linfocitos T . El receptor CB2 se detecta principalmente en las células inmunitarias, pero también en las neuronas y otras células que componen el sistema nervioso central, como los astrocitos y la microglía, así como en las células endoteliales cerebromicrovasculares . La activación de los receptores CB inhibe la formación de AMPc a través de su acoplamiento a las proteínas Gi, lo que provoca una disminución de la fosforilación dependiente de la proteína quinasa A (PKA) . Los receptores CB también se acoplan a la quinasa regulada por señales extracelulares (ERK) y específicamente a p42/p44 y p38 , participando en la fosfatidilinositol 3-cinasa (PI3K) y en la señalización de la ceramida . Otros receptores también se unen al ECS como el canal de cationes de potencial de receptor transitorio subfamilia V miembro 1 (TRPV-1), los receptores activados por el proliferador de peroxisomas (PPARs), y los receptores acoplados a la proteína G no CB1/CB2 GPR55 .
Los ligandos del ECS son los cannabinoides, incluyendo los componentes bioactivos del Cannabis Sativa, los compuestos sintéticos CB-miméticos, y los ligandos endógenos de los receptores CB . La molécula más importante de la primera categoría es el Δ9-THC, que es bien conocido por sus rasgos psicoactivos . Las otras dos categorías incluyen los ligandos sintéticos que se han desarrollado en la actualidad (CP55940, HU-210, HU-211, ab-cannabidiol, ácido ajulémico, WIN55,212-2) y los endocannabinoides que son producidos por el cuerpo humano y son derivados lipídicos mensajeros del ácido araquidónico (AA) conjugados con etanolamina o glicerol . Las más importantes de estas moléculas son la anandamida (AEA) y el 2-araquidonilglicerol (2-AG), pero también se han identificado otras sustancias, como la O-araquidoniletanolamina (OAE, virodhamina), el éter de 2-araquidonilglicerol (2-AGE, éter de noladina), la N-araquidonildopamina (NADA) y la palmitoiletanolamida (PEA) . Además de los receptores CB y todos sus ligandos, el SCE también incluye las enzimas esenciales para la biosíntesis, el transporte y la degradación del ligando.
Además de las funciones del SCE para mantener la homeostasis, la mencionada interacción entre el SCE y las vías oncogénicas más importantes (la vía MAPK/ERK y la vía PI3K/Akt) ha cobrado interés recientemente y ha puesto de manifiesto la importancia del SCE en la tumorigénesis. Además, se ha demostrado que los cannabinoides inducen la apoptosis en las células cancerosas, inhiben la vascularización del tumor mediante la disminución del VEGF y suprimen la capacidad invasiva de las células cancerosas . Los efectos antiproliferativos prevalecen y varios estudios sugieren que los cannabinoides tienen potencial como agentes antitumorales.
El diagnóstico de las lesiones tiroideas se ha incrementado recientemente, no sólo debido a la mejora de las técnicas de diagnóstico, sino también por su verdadero aumento de incidencia en la población . De hecho, el carcinoma de tiroides es la neoplasia más frecuente del sistema endocrino . Aunque el cáncer de tiroides suele curarse completamente mediante cirugía y terapia, el 10-20% de los pacientes siguen muriendo por recidiva o progresión del tumor . Por lo tanto, es esencial establecer nuevas estrategias de tratamiento y encontrar nuevos marcadores de pronóstico para predecir el curso clínico de cada paciente y personalizar en consecuencia las modalidades terapéuticas disponibles. En este aspecto, el presente estudio tuvo como objetivo evaluar la expresión inmunohistoquímica de los receptores CB1 y CB2 en lesiones tiroideas benignas y malignas en asociación con características clinicopatológicas relacionadas con el pronóstico.
2. Pacientes y Métodos
2.1. Pacientes
El material examinado consistió en 87 especímenes quirúrgicos tiroideos examinados histológicamente de un número igual de pacientes que habían sido sometidos a cirugía tiroidea por lesiones benignas y malignas. Se incluyeron en el estudio 43 casos benignos (37 nódulos hiperplásicos y 6 tiroiditis de Hashimoto) y 44 malignos (40 carcinomas papilares y 4 foliculares). Cada neoplasia se clasificó según la clasificación histológica de los tumores de tiroides de la OMS. El riesgo de recidiva se estimó según el sistema de estadificación de la American Thyroid Association (ATA) . Ninguno de los pacientes había recibido ningún tipo de tratamiento anticanceroso antes de la cirugía y no había antecedentes clínicos de irradiación de cabeza y cuello o de otro cáncer.
2.2. Inmunohistoquímica
Se realizaron inmunotinciones para CB1 y CB2 en secciones de tejido tiroideo fijadas con formalina e incluidas en parafina utilizando un anticuerpo policlonal CB1 IgG de cabra (N-15, sc-10066, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) y un anticuerpo policlonal CB2 IgG de conejo (H-60, sc-25494, Santa Cruz Biotechnology). Brevemente, las secciones de tejido de 4 μm de grosor se desparafinaron en xileno y se llevaron al agua mediante alcoholes graduados. La recuperación de antígenos se realizó mediante el microondas de los portaobjetos en tampón citrato 10 mM (pH 6,1) durante 15 minutos (min) a alta potencia, según las instrucciones del fabricante. Para eliminar la actividad de la peroxidasa endógena, las secciones se trataron con peróxido de hidrógeno al 0,3% recién preparado en metanol en la oscuridad, durante 30 minutos, a temperatura ambiente. La unión inespecífica de anticuerpos se bloqueó utilizando Eraser y Sniper, reactivos de bloqueo específicos para anticuerpos primarios de cabra y conejo, respectivamente (Biocare Medical, Concord, California, EE.UU.), durante 5 min. Las secciones se incubaron durante 1 hora (h), a temperatura ambiente, con los anticuerpos primarios contra CB1 y CB2 diluidos 1 : 300 y 1 : 200, respectivamente, en solución salina tamponada con fosfato (PBS) según las instrucciones del fabricante. A continuación, las secciones se incubaron a temperatura ambiente con el reactivo de enlace biotinilado (Biocare Medical) durante 10 minutos, seguido de la incubación con la etiqueta de estreptavidina conjugada con peroxidasa (Biocare Medical) durante 10 minutos. La actividad inmuno-peroxidasa resultante se reveló utilizando un kit de sustrato DAB (Vector Laboratories, California, EE.UU.) durante 10 min. Las secciones se contratinaron con hematoxilina de Harris y se montaron en Entellan (Merck, Darmstadt, Alemania). Se realizaron controles negativos apropiados omitiendo el anticuerpo primario y/o sustituyéndolo por un antisuero irrelevante. Como control positivo, se utilizaron secciones de tejido de carcinoma de células escamosas de mama y lengua móvil con expresión conocida de CB1 y CB2. La capacidad proliferativa de las células foliculares se evaluó mediante la expresión inmunohistoquímica de Ki-67, tal y como se ha descrito previamente.
2.3. Evaluación de la inmunohistoquímica
La evaluación inmunohistoquímica se realizó mediante el recuento de al menos 1000 células tumorales en cada caso por parte de dos observadores independientes (Stamatios Theocharis y Paraskevi Alexandrou) cegados a los datos clínicos, con una concordancia completa de los observadores. Los especímenes se consideraron «positivos» para CB1 y CB2 cuando más del 5% de las células tumorales de la sección se tiñeron positivamente. La inmunoreactividad de las células tumorales para CB1 y CB2 se puntuó según el porcentaje de células tumorales positivas para CB1 y CB2 como 0: tinción negativa – 0-4% de las células tumorales positivas; 1: 5-24% de las células tumorales positivas; 2: 25-49% de las células tumorales positivas; 3: 50-100% de las células tumorales positivas y su intensidad como 0: tinción negativa, 1: tinción leve; 2: tinción intermedia; 3: tinción intensa . Finalmente, la expresión de CB1 y CB2 se clasificó como baja, si la tinción total era 0 o 2 y alta y si la tinción total era ≥3 . La inmunorreactividad del Ki-67 se clasificó según el porcentaje de células foliculares teñidas positivamente que superaba el valor porcentual medio en dos categorías (por debajo y por encima del valor medio), tal y como se informó anteriormente.
2.4. Análisis estadístico
Se utilizaron pruebas de Chi-cuadrado para evaluar la diferencia de expresión de CB1 y CB2 entre las lesiones tiroideas malignas y benignas, así como entre los casos de carcinoma papilar y los nódulos hiperplásicos. Se aplicaron pruebas de Chi-cuadrado para evaluar las asociaciones entre la expresión de CB1 y CB2 y las características clinicopatológicas en el subgrupo de pacientes con lesiones tiroideas malignas. Se consideró estadísticamente significativa una prueba de 2 colas. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el paquete de software SPSS para Windows (versión 13.0; SPSS Inc., Chicago, IL, EE.UU.).
3. Resultados
3.1. Significado clínico de la expresión de CB1 en lesiones tiroideas humanas malignas y benignas
Se observó positividad de CB1 (puntuación IHC > 0) en 52 (60%) de las 87 lesiones tiroideas. Treinta y uno (36%) de los 87 casos examinados presentaron una alta inmunorreactividad de CB1 (puntuación IHC ≥ 3). El patrón subcelular de distribución de CB1 era predominantemente citoplasmático y ocasionalmente membranoso. Las áreas circundantes normales adyacentes al tumor resultaron negativas para CB1. En las Figuras 1(a) y 1(b) se muestran inmunotinciones representativas de CB1 para el nódulo hiperplásico y el carcinoma papilar, respectivamente. La inmunorreactividad de CB1 fue significativamente diferente entre las lesiones tiroideas benignas y malignas (Tabla 1, ). La alta expresión de CB1 se observó con mayor frecuencia en el carcinoma papilar en comparación con los nódulos hiperplásicos (Tabla 1, ). La expresión de CB1 no se asoció a la edad y el sexo de los pacientes ni a la capacidad proliferativa de las células foliculares. En el subgrupo de lesiones tiroideas malignas, se observó una alta expresión de CB1 en 23 (52%) de los 44 casos. No hubo asociación entre la expresión del receptor CB1 y el tamaño del tumor, la presencia de invasión capsular, vascular o linfática, la metástasis en los ganglios linfáticos y la tasa de proliferación de las células foliculares (Tabla 2). La expresión del receptor CB1 no se asoció con el riesgo de recidiva estimado según el sistema de estadificación ATA (datos no mostrados).
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(a)
(b)
(c)
(d)
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(b)
(c)
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3.2. Significado clínico de la expresión de CB2 en lesiones tiroideas humanas malignas y benignas
La positividad de CB2 (puntuación IHC > 0) se observó en 61 (71%) de las 87 lesiones tiroideas. Treinta y dos (37%) de los 87 casos examinados presentaron una alta inmunorreactividad de CB2 (puntuación IHC ≥ 3). El patrón subcelular de distribución era predominantemente citoplasmático y ocasionalmente membranoso. Las áreas circundantes normales adyacentes al tumor se encontraron negativas para CB2. En las figuras 1(c) y 1(d) se muestran inmunotinciones representativas de CB2 para nódulos hiperplásicos y carcinoma papilar, respectivamente. La alta expresión de CB2 se observó con mucha más frecuencia en las lesiones tiroideas malignas en comparación con las benignas, así como en el carcinoma papilar en comparación con los nódulos hiperplásicos (Tabla 1, y , respectivamente). En el subgrupo de lesiones tiroideas malignas, se observó una alta expresión de CB2 en 24 (55%) de los 44 casos. La alta expresión de CB2 se asoció significativamente con la presencia de metástasis en los ganglios linfáticos (Tabla 2, ). La expresión elevada de CB2 también se asoció con la presencia de invasión capsular, linfática y vascular, aunque a un nivel no significativo (Tabla 2, , y , respectivamente). No se observó ninguna asociación entre la expresión de CB2 y la edad y el sexo de los pacientes, el tamaño del tumor y la tasa de proliferación de las células foliculares (Tabla 2). La alta expresión del receptor CB2 se observó con mayor frecuencia en las lesiones tiroideas malignas que presentaban un mayor riesgo de tasa de recurrencia según el sistema de estadificación ATA, a un nivel no significativo, sin embargo ().
4. Discusión
En el presente estudio, la expresión de las proteínas CB1 y CB2 estaba aumentada en las lesiones tiroideas malignas en comparación con las benignas. También describimos por primera vez una asociación entre la expresión de la proteína CB2 y los parámetros clinicopatológicos cruciales para el manejo y el pronóstico de los pacientes. En particular, el aumento de la expresión de CB2 se asoció de forma significativa con la presencia de metástasis en los ganglios linfáticos y de forma limítrofe con la presencia de invasión vascular, mientras que también se observaron asociaciones indicativas pero no significativas con la presencia de invasión capsular y linfática y la tasa de recurrencia estimada. Se obtuvieron resultados similares para la sobreexpresión del receptor CB1, en lo que respecta a las lesiones malignas de tiroides en comparación con las benignas; no obstante, se observó una asociación o tendencia no significativa de correlación entre la expresión de CB1 y los parámetros clinicopatológicos.
De acuerdo con los presentes hallazgos, los receptores CB estaban regulados al alza en ciertos tumores humanos malignos, incluyendo el carcinoma oral de células escamosas, el carcinoma pancreático, hepatocelular y prostático, mientras que no se expresaban en los tejidos normales de estos órganos . Por otra parte, el receptor CB1 estaba regulado a la baja en el carcinoma colorrectal en contraste con los tejidos normales adyacentes, lo que apunta a las diferentes funciones del SCE en diversos tumores e indica las múltiples interacciones entre el SCE y los mecanismos que controlan el crecimiento y la proliferación celular . Estos mecanismos pueden incluir la inducción directa de la muerte de las células transformadas, la detención del ciclo celular y la inhibición de la angiogénesis tumoral y la metástasis . Los efectos antitumorales de los SCE también se han descrito en numerosos estudios. En el cáncer colorrectal, los endocannabinoides y los cannabinoides sintéticos fueron capaces de inducir la apoptosis e inhibir la carcinogénesis mediante mecanismos que implican tanto a los receptores CB como a los canales TRPV1 y a la vía PPARγ . Se han obtenido resultados similares en estudios realizados sobre el cáncer de páncreas, pulmón y mama, el colangiocarcinoma y el carcinoma hepatocelular . También se ha informado de los efectos sinérgicos de los cannabinoides con la quimioterapia antitumoral convencional.
Recientemente se ha informado de la sobreexpresión del receptor CB en el carcinoma de tiroides, in vitro . Más concretamente, la estimulación con IL-12 de líneas celulares de carcinoma anaplásico de tiroides indujo la sobreexpresión del receptor CB2 y condujo a la apoptosis mediada por agonistas CB2 y a la regresión del tumor. Además, la sobreexpresión de CB2 hizo que las células tumorales fueran más susceptibles al tratamiento con quimioterapia estándar. Una posible explicación de este fenómeno fue la activación dependiente de la ceramida de la vía intrínseca mitocondrial, que conduce a la apoptosis, desencadenada por la activación del receptor CB2. Otro estudio sobre líneas celulares de carcinoma de tiroides describió que la 2-metil-2′-F-anandamida (Met-F-AEA) inhibía el crecimiento del tumor, asociado a altos niveles del receptor CB1 . La abundante expresión del receptor CB1 se observó en las líneas celulares más sensibles al tratamiento, que posteriormente fueron más susceptibles a la inhibición del crecimiento. Tales resultados se atribuyeron a la activación de p53, el aumento, y la disminución de ciclina A, lo que conduce a la apoptosis .
Aparte de las posibles implicaciones terapéuticas en relación con la tumorigénesis y el SCE, la detección de la sobreexpresión de los receptores CB puede tener potencial como indicadores de pronóstico. La sobreexpresión de ambos receptores CB en muestras de tejido de carcinoma hepatocelular se asoció significativamente con un mejor pronóstico y una mayor supervivencia libre de enfermedad . Estos resultados se combinaron con las características histopatológicas del tumor, ya que se observaron niveles elevados de receptores CB en los casos que presentaban una buena diferenciación y una afectación limitada del tracto portal . Por otro lado, la inmunorreactividad de CB2 se asoció a una menor supervivencia libre de enfermedad en el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello. En cuanto al receptor CB1, su sobreexpresión se asoció a un mal resultado de los pacientes con carcinoma colorrectal, prostático y pancreático. En particular, el aumento de la expresión de CB1 en pacientes con carcinoma colorrectal en estadio IV se correlacionó de forma independiente con un mal pronóstico. El aumento de la expresión de CB1 también se asoció con un adenocarcinoma prostático agresivo que presentaba una mayor puntuación de Gleason, un mayor tamaño del tumor y una mayor tasa de proliferación celular, así como metástasis en el momento del diagnóstico. Además, la baja expresión de CB1 o los altos niveles de FAAH/MAGL se correlacionaron con una mayor tasa de supervivencia y un mayor estado de dolor. Se observaron resultados similares pero no estadísticamente significativos para el receptor CB2 . Teniendo en cuenta los datos mencionados, los estudios actualmente disponibles sobre los niveles de receptores CB y sus asociaciones con el pronóstico en diversos tumores parecen contradictorios y pueden estar estrechamente relacionados con el grado de participación del SCE en la tumorigénesis.
5. Conclusión
Los niveles de expresión inmunohistoquímica de los receptores CB1 y CB2 se correlacionaron con la malignidad de la glándula tiroides. Además, el aumento de los niveles de expresión de CB2 se asoció con características clinicopatológicas importantes para el manejo terapéutico de los pacientes. Estos resultados apoyan la evidencia de que los receptores CB, y especialmente el receptor CB2, pueden interferir con las vías moleculares que participan en la transformación maligna de la tiroides y podrían ser considerados como potenciales objetivos terapéuticos para suprimir la progresión del tumor. Se recomienda encarecidamente la realización de estudios de cohorte más amplios para confirmar y establecer la utilidad clínica de los receptores CB como posibles marcadores de pronóstico en la neoplasia de tiroides.
Conflicto de intereses
Todos los autores verifican que no han aceptado ninguna financiación o apoyo de una organización que pueda ganar o perder económicamente de alguna manera los resultados del presente estudio. Todos los autores verifican que no han sido empleados por una organización que pueda de alguna manera ganar o perder financieramente de los resultados del presente estudio. Ninguno de los autores tiene ningún otro conflicto de intereses.
Contribución de los autores
Eleftheria Lakiotaki y Constantinos Giaginis contribuyeron por igual al estudio.
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