Resumen de las enzimas histonas desacetilasas clásicas y de los inhibidores de las histonas desacetilasas

Abstracto

El importante papel de las enzimas histonas desacetilasas en la regulación de la expresión génica, la proliferación celular y la supervivencia las ha convertido en objetivos atractivos para el desarrollo de inhibidores de las histonas desacetilasas como fármacos contra el cáncer. El ácido hidroxámico suberoilanilida (Vorinostat, Zolinza), un análogo estructural de la tricostatina A prototípica, fue aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos de Estados Unidos para el tratamiento del linfoma cutáneo de células T avanzado en 2006. A esto le siguió la aprobación del péptido cíclico depsipéptido (Romidepsin, Istodax) para la misma enfermedad en 2009. En la actualidad, numerosos inhibidores de la histona deacetilasa están siendo sometidos a ensayos preclínicos y clínicos para el tratamiento de neoplasias hematológicas y sólidas. La mayoría de estos estudios se centran en las combinaciones de los inhibidores de la histona deacetilasa con otras modalidades terapéuticas, en particular la quimioterapia convencional y la radioterapia. El objetivo de este artículo es proporcionar una visión general de las enzimas histona deacetilasas clásicas y de los inhibidores de la histona deacetilasas, haciendo hincapié en las posibles terapias combinadas.

1. Introducción

La cromatina es una estructura dinámica que, a través de numerosos mecanismos que incluyen la metilación del ADN y las modificaciones postraduccionales de las histonas, sufre una remodelación para facilitar los procesos metabólicos que incluyen la transcripción, la replicación y la reparación . Una de las modificaciones postraduccionales de las histonas más investigadas es la acetilación, que se definió por primera vez en la década de 1960. La acetilación de las histonas está controlada por las acciones opuestas de dos grupos de enzimas, las histonas acetiltransferasas (HAT) y las histonas desacetilasas (HDAC). Las HAT catalizan la transferencia del acetilo del sustrato acetil-coA al grupo ε-amino de los residuos de lisina de las histonas. Esto neutraliza la carga positiva de las histonas, debilitando su interacción con el ADN cargado negativamente. El resultado es una conformación de la cromatina más relajada y permisiva para la transcripción. Las enzimas HDAC eliminan los grupos acetilo de las histonas, lo que da lugar a un estado de la cromatina más condensado y transcripcionalmente represivo.

Las 18 enzimas HDAC de mamíferos identificadas hasta la fecha se clasifican en dos grupos distintos. Las enzimas HDAC de clase III, que incluyen las sirtuinas 1-7, necesitan nicotinamida adenina dinucleótido (NAD+) para desacetilar residuos de lisina. Se han relacionado con numerosas enfermedades y con el proceso de envejecimiento. Las 11 enzimas restantes se conocen típicamente como las enzimas HDAC clásicas y serán el centro de atención del resto de este artículo. El intenso interés por la función y la manipulación farmacológica de estas enzimas siguió rápidamente a la clonación y caracterización inicial de las primeras HDAC humanas en la década de 1990. Las diferentes isoformas de las enzimas HDAC clásicas han sido objeto de un extenso análisis filogenético y se agrupan en tres clases diferentes (Figura 1) . Las enzimas de la clase 1, compuestas por las HDAC1, 2, 3 y 8, que comparten similitudes con el regulador transcripcional de la levadura RDP3, se localizan principalmente en el núcleo. Se expresan de forma ubicua y tienen un importante papel funcional en la regulación de la proliferación y la supervivencia celular. Por el contrario, las enzimas HDAC de clase II, que comparten homología con la Hda1 de la levadura, se desplazan entre el citoplasma y el núcleo, y tienen patrones de expresión específicos de los tejidos y funciones reguladoras más restringidas. Las enzimas de clase II se subdividen a su vez en clase IIa (HDAC4, 5, 7 y 9, que se desplazan entre el núcleo y el citoplasma) y clase IIb (HDAC6 y 10, principalmente citoplasmáticas). Las funciones de las diferentes isoformas de las enzimas HDAC han sido revisadas recientemente. De particular interés es la HDAC6, una de las principales desacetilasas citoplasmáticas que ha sido relativamente bien caracterizada, al menos en parte, debido al trabajo con tubacina, un inhibidor específico . Se han identificado numerosas dianas proteicas no histónicas para la HDAC6, como la α-tubulina, la cortactina, otras chaperonas y las peroxiredoxinas. Su importante papel en la proliferación y la supervivencia celular ha convertido a la HDAC6 en una importante diana para la terapia del cáncer. Recientes hallazgos han indicado los efectos citotóxicos y apoptóticos combinados del inhibidor específico de la HDAC6, la tubacina, con los agentes quimioterapéuticos convencionales en las células cancerosas, pero no en las normales. Además, se ha demostrado que la HDAC6 es un objetivo importante para la protección y la regeneración tras una lesión del sistema nervioso central. La HDAC11 es el único miembro de la clase IV que comparte similitudes con las enzimas de clase I y de clase II. Pruebas recientes indican que la HDAC11 tiene funciones inmunomoduladoras .

Figura 1

Relación evolutiva entre las enzimas histonas desacetilasas clásicas (HDACs). La superfamilia HDAC forma grupos evolutivamente distintos según su homología de secuencia con la levadura. Las enzimas de la clase I comparten similitudes con la levadura, la dependencia reducida de potasio-3 (Rpd3), y consisten en las HDAC1, 2, 3 y 8. Rpd3 es la más homóloga a HDAC1 y HDAC2. Las HDAC de clase II comparten homología con la levadura, la histona desacetilasa-1 (Hda1), y las enzimas de esta clase forman dos subclases separadas. La clase IIa está formada por las HDAC4, 5, 7 y 9; la clase IIb está formada por las HDAC6 y 10. La Hda1 está más estrechamente relacionada con la HDAC6. El árbol filogenético muestra que la HDAC11 no comparte suficiente homología con las HDAC de clase I o clase II, por lo que forma la clase IV y comparte cierta identidad con Rpd3 y Hda1. El porcentaje de identidad/similitud de la secuencia de aminoácidos de la HDAC con la de Rpd3 o Hda1 se muestra entre paréntesis, para la HDAC11 se muestra la identidad/similitud de la secuencia con Hda1 y con Rpd3. Las HDACs tienen un dominio de desacetilasa (DAC) conservado con las colas C- y N-terminal representadas como líneas negras. Se muestran las señales de localización nuclear, los dominios de unión al factor potenciador de miocitos 2 (MEF2) y los motivos de unión a la chaperona 14-3-3 con sitios de fosforilación de serina. El número de residuos de aminoácidos de la isoforma más larga de cada HDAC se muestra a la derecha, y el sitio cromosómico de cada HDAC se muestra entre paréntesis. H. sapiens: Homo sapiens; S. cerevisiae: Saccharomyces cerevisiae; SE14: repeticiones de tetradecapéptidos que contienen Ser-Glu; ZnF: dominio de dedo de zinc de unión a ubiquitina. Adaptado de .

2. Inhibidores de la histona desacetilasa

Se conocen varios grupos estructurales diferentes de compuestos que poseen actividad inhibidora de la HDAC. El inhibidor de HDAC más investigado es el ácido hidroxámico prototípico, la tricostatina A . La tricostatina A es un potente antibiótico antifúngico que se aisló a partir de un metabolito de Streptomyces hygroscopicus . Es un potente inhibidor de HDAC de amplio espectro, con ensayos libres de células que indican una afinidad relativamente alta por todas las enzimas de clase I, II y IV. Otro ejemplo de hidroxámico es el ácido hidroxámico suberoilanilida (SAHA, Vorinostat, Zolinza), disponible clínicamente. Al igual que la tricostatina A, el SAHA es un potente inhibidor de HDAC de amplio espectro. Dados sus potentes efectos anticancerígenos y su favorable ventana terapéutica, el SAHA fue aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA) para el tratamiento del linfoma cutáneo de células T (CTCL) avanzado en 2006 . Otros ácidos hidroxámicos actualmente en fase de ensayo clínico son el belinostat (PXD101), el panobinostat (LBH589) y el givinostat (ITF-2357) . Esta clase de compuestos posee una actividad de inhibición de la HDAC en el rango nanomolar a micromolar bajo.

Los péptidos cíclicos que incluyen la trapoxina y el depsipéptido son también potentes inhibidores de la HDAC. El depsipéptido (Romidepsin, Istodax) también ha sido aprobado por la FDA para el tratamiento del CTCL en 2009. Del mismo modo, las benzamidas, que incluyen el entinostat (MS-275, SNDX 275) y el MGCD0103, son potentes inhibidores de las HDAC con una actividad en el rango micromolar bajo. La clase menos potente de inhibidores de la HDAC es la de los ácidos alifáticos, que poseen una actividad en el rango milimolar. Este grupo incluye el ácido valproico, un compuesto que se ha utilizado ampliamente en la clínica como fármaco antiepiléptico. Hemos utilizado otro ejemplo de ácido alifático, el butirato de sodio, para destacar los efectos anticancerígenos de los inhibidores de la histona desacetilasa (Figura 2).

Brevemente, los inhibidores de la HDAC dan lugar a la acumulación de histonas hiperacetiladas y se ha demostrado que alteran la expresión de aproximadamente el 2-20% de los genes en líneas celulares malignas . En general, se ha demostrado que los inhibidores de las HDACs disminuyen la proliferación celular, inducen la muerte celular, la apoptosis y la diferenciación, provocan la detención del ciclo celular (G1 en concentraciones bajas y tanto G1 como G2/M en concentraciones relativamente altas) y disminuyen la migración, la invasión y la angiogénesis en líneas celulares malignas y transformadas . Los efectos de los inhibidores de la HDAC son mucho menos pronunciados, al menos en un factor 10, en las células normales, lo que constituye la base de su utilidad clínica en el cáncer. Para mejorar potencialmente el índice terapéutico de los inhibidores de las HDAC en la terapia del cáncer, se han sugerido compuestos selectivos de clase o específicos de isoforma. En este contexto, la tubacina y el PC-34051, que inhiben selectivamente la HDAC6 y la HDA8, respectivamente, son ejemplos de isoformas específicas. Recientemente se ha demostrado que ambos compuestos tienen efectos anticancerígenos. Sin embargo, la cuestión de la selectividad sigue siendo controvertida, con argumentos que sugieren que los efectos pleiotrópicos de los inhibidores de HDAC de amplio espectro, que generalmente son bien tolerados, pueden ser ventajosos para la terapia del cáncer dada la heterogeneidad y adaptabilidad de las células malignas. Sin embargo, se acepta generalmente que los compuestos selectivos serán probablemente más beneficiosos para las aplicaciones no oncológicas de los inhibidores de la HDAC, que incluyen potencialmente el tratamiento de la hipertrofia cardíaca, el asma y diversos trastornos neurodegenerativos.

3. Terapias combinatorias con inhibidores de la histona desacetilasa

Aunque poseen efectos anticancerígenos intrínsecos, se acepta ampliamente que los inhibidores de la HDAC serán más eficaces cuando se utilicen en combinación con otras modalidades de cáncer. Existen numerosas combinaciones que se están evaluando actualmente de forma preclínica y clínica. Entre ellas se encuentran las combinaciones con inhibidores de la metiltransferasa, como la azacitidina, citotóxicos mediados por receptores, como el ácido retinoico, y la fototerapia . Para destacar las ventajas y las posibles complejidades, aquí nos centraremos en las combinaciones de los inhibidores de la HDAC con los quimioterapéuticos de antraciclina convencionales y la radioterapia (Figura 3).

(a)

(b)

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Las antraciclinas, tipificadas por la daunomicina y su análogo estructural la doxorrubicina, son agentes quimioterapéuticos de primera línea contra el cáncer con una historia clínica que abarca más de 50 años . Son conocidos intercaladores del ADN e inhibidores de la enzima topoisomerasa II. Los mecanismos de acción de las antraciclinas implican la inhibición de la síntesis de ARN, la generación de especies reactivas de oxígeno y la acumulación de lesiones en el ADN, incluidas las roturas de doble cadena del ADN, que son especialmente letales. Una gran cantidad de estudios han demostrado que los inhibidores de la HDAC pueden potenciar los efectos citotóxicos de las antraciclinas. Por ejemplo, se ha demostrado que la tricostatina A aumenta la apoptosis inducida por la doxorrubicina y la muerte celular en las células eritroleucémicas humanas K562, el carcinoma anaplásico de tiroides y las células de adenocarcinoma alveolar A549. Asimismo, se ha demostrado que el SAHA y el ácido valproico aumentan la sensibilidad de las células malignas a los efectos de la doxorrubicina. Los inhibidores de la HDAC inducen la hiperacetilación de las histonas, lo que da lugar a una conformación de la cromatina más abierta y permisiva para la transcripción, un fenómeno que se ha verificado mediante ensayos de digestión con MNasa . Además, se ha demostrado que los inhibidores de la HDAC aumentan el número de sitios de unión y también la afinidad de esos sitios por las antraciclinas en la cromatina acetilada . Por lo tanto, se puede especular que los inhibidores de las HDACs pueden aumentar la muerte celular inducida por las antraciclinas, al menos en parte, al cambiar la arquitectura de la cromatina. Sin embargo, también están implicados los cambios en la expresión génica y la alteración de la función de los sustratos no histónicos mediada por los inhibidores de la HDAC, como han puesto de manifiesto los estudios con inhibidores selectivos de las isoformas.

El efecto citotóxico aditivo y/o sinérgico proporciona la base para los ensayos clínicos que utilizan combinaciones de inhibidores de la histona desacetilasa y antraciclinas para diversas neoplasias malignas . Sin embargo, se han identificado posibles complicaciones. Por ejemplo, se ha demostrado que el depsipéptido regula al alza el gen MDR1 en las células de la leucemia, lo que provoca una resistencia a la doxorrubicina. Se sabe que la expresión de la bomba de glicoproteína P, codificada por MDR1, da lugar a la resistencia a múltiples fármacos, un importante problema clínico en oncología, y otros estudios han indicado la posibilidad de revertir la represión del gen MDR1 en las células malignas mediante diversos inhibidores de HDAC . Por el contrario, otros estudios más recientes han indicado que los inhibidores de la HDAC pueden suprimir la expresión de los transportadores ABC, lo que pone de manifiesto que esta cuestión requiere una mayor aclaración.

Otra posible complicación con el uso de los inhibidores de la HDAC es la toxicidad cardíaca. Los estudios han demostrado que los inhibidores de HDAC de amplio espectro pueden poseer actividad cardiotóxica per se . Otros estudios han demostrado que el pretratamiento con inhibidores de la HDAC potencia los efectos citotóxicos y dañinos para el ADN de la doxorrubicina en sistemas de cultivo celular. Es bien sabido que el efecto secundario que limita la dosis de las antraciclinas es la toxicidad cardíaca irreversible debida a la generación de especies reactivas de oxígeno, incluidos los dañinos radicales hidroxilo y peróxido de hidrógeno. Los cardiomiocitos son particularmente susceptibles dado que tienen niveles relativamente bajos de anión superóxido y enzimas desintoxicantes de peróxido de hidrógeno en comparación con otros tipos de células . Los estudios que utilizan las respuestas hipertróficas y la inducción de roturas de la doble cadena del ADN como criterios de valoración han indicado que los inhibidores de la HDAC de amplio espectro, la tricostatina A, el ácido valproico y el butirato sódico, aumentan los efectos de la doxorrubicina. Del mismo modo, los estudios in vivo ponen de manifiesto las controversias relativas a la biología de los inhibidores de las HDAC en el corazón. Por ejemplo, hallazgos recientes demuestran que la tricostatina A y el ácido valproico protegen de la hipertrofia cardíaca inducida por cargas y agonistas in vivo . Sin embargo, hallazgos opuestos indican que la tricostatina A empeora la disfunción del ventrículo derecho inducida por el anillado de la arteria pulmonar en ratas . Dadas estas posibles complicaciones, los efectos combinados de los inhibidores de la HDAC más selectivos o específicos de una isoforma con las terapias convencionales pueden proporcionar una ventaja terapéutica. En este contexto, un estudio reciente identificó que el compuesto selectivo de la HDAC6, la tubacina, potencia los efectos de la doxorrubicina y el etopósido en líneas celulares transformadas . Se prevén más evaluaciones en este sentido.

4. Combinación de inhibidores de la histona desacetilasa con radioterapia

Los primeros estudios indicaron que el ácido graso de cadena corta, butirato sódico, potencia las células cancerosas de colon y nasofaringe a los efectos citotóxicos de la radiación ionizante . Aunque se utilizó un mecanismo inusual para describir el efecto, un estudio posterior indicó que el inhibidor prototípico de la HDAC, la tricostatina A, también potencia la radiosensibilidad de las células malignas . Otros estudios han corroborado estos resultados indicando que prácticamente todos los inhibidores de HDAC de amplio espectro, incluidos la tricostatina A, el SAHA, el depsipéptido, el butirato sódico, el fenilbutirato, la tributirina y el ácido valproico, potencian la muerte celular inducida por la radiación en las células malignas . A concentraciones relativamente altas del inhibidor de la HDAC, se han observado factores de modificación de la dosis (relación entre las dosis de radiación en las células tratadas y no tratadas con el inhibidor de la HDAC que producen el mismo nivel de supervivencia) de ~2 . A estas concentraciones más altas, se ha especulado que la detención del ciclo celular (G1 y G2), la inhibición de la síntesis de ADN y la inducción de la apoptosis por parte de los inhibidores de la HDAC explican el efecto sensibilizador de la radiación. A concentraciones relativamente bajas de inhibidores de las HDAC, también se observa un efecto sensibilizador a la radiación. Varios estudios han establecido una asociación entre la inhibición de las HDAC y las proteínas implicadas en las cascadas de señales en respuesta al daño del ADN. En resumen, los efectos sensibilizadores a la radiación de los inhibidores de la HDAC pueden implicar los siguientes mecanismos. En primer lugar, la hiperacetilación de las histonas cambia la arquitectura de la cromatina dando lugar a una confirmación de cromatina más abierta, que puede ser más susceptible al daño inicial del ADN inducido por la radiación. Además, los inhibidores de las HDAC pueden interactuar con proteínas clave de transducción de señales implicadas en las vías de respuesta al daño del ADN. Por último, se ha demostrado que los inhibidores de la HDAC regulan la transcripción de los genes implicados en la vía de reparación de las roturas de la doble cadena del ADN. Por ejemplo, se ha demostrado que el pretratamiento con SAHA atenúa el aumento inducido por la radiación de las proteínas de reparación del ADN Rad51 y DNA-PKcs . Del mismo modo, se ha demostrado que el butirato de sodio disminuye la expresión de las proteínas de reparación del ADN Ku70, Ku86 y DNA-PKcs en líneas celulares de melanoma. Además, utilizando bleomicina, doxorrubicina y etopósido para inducir roturas de doble cadena del ADN, evaluadas por la acumulación de focos de γH2AX, se ha demostrado que los inhibidores de la histona desacetilasa se dirigen a la acetilación de Ku70, lo que da lugar a la sensibilización.

En el contexto de las combinaciones con la radioterapia, el ácido valproico, que tiene una larga historia clínica en el tratamiento de la epilepsia, es importante . Los estudios preclínicos han indicado que el inhibidor de la HDAC sensibiliza las líneas celulares de glioma humano a los efectos de la radiación ionizante (rayos X) tanto in vitro como in vivo . Como se ha revisado recientemente, el ácido valproico se ha combinado con el agente alquilante temozolomida y la radiación para el tratamiento potencial del glioblastoma multiforme. Esta estrategia se está evaluando actualmente en un ensayo clínico de fase II.

5. Efectos radioprotectores de los inhibidores de la histona desacetilasa

Paradójicamente, están surgiendo pruebas que indican que los inhibidores de la HDAC poseen actividades radioprotectoras. Los primeros estudios indicaron que el pretratamiento con fenilbutirato ofrece un modesto efecto radioprotector en células humanas normales y cancerosas . Otros estudios indicaron que el fenilbutirato protege del síndrome de la radiación cutánea in vivo. Se cree que las propiedades radioprotectoras de los inhibidores de la HDAC implican la represión de las citoquinas inflamatorias (por ejemplo, la interleucina (IL-) 1, la IL-8, el factor de necrosis tumoral (TNF-)α) y los factores de crecimiento fibrogénicos (por ejemplo, el factor de crecimiento transformante (TGF-)β) . Se sabe que estos están implicados en la respuesta inflamatoria a la radiación y, en particular, la secreción prolongada de TNF-α y TGF-β de las células epiteliales, endoteliales y del tejido conectivo está implicada en el síndrome de la radiación cutánea. Además del fenilbutirato, se ha demostrado que los inhibidores de amplio espectro de la HDAC, la tricostatina A y el ácido valproico, protegen de las lesiones cutáneas inducidas por la radiación y de la letalidad inducida por la radiación en ratones. Estos efectos también se correlacionaron con la disminución de la expresión de TNF-α, TGF-β1 y TGF-β2 . Otras investigaciones en este sentido con fenilbutirato han indicado que el inhibidor de la HDAC puede proteger a los ratones de la letalidad aguda inducida por la radiación γ. Los efectos se correlacionaron con una atenuación del daño al ADN y la apoptosis . Resulta interesante que la administración profiláctica y postirradiación de fenilbutirato ofrezca radioprotección, lo que presenta interesantes aplicaciones clínicas potenciales. La profilaxis sería apropiada para la radioterapia antes de la exposición a la irradiación, y las administraciones postirradiación serían apropiadas en casos de exposición inadvertida a la radiación.

6. Conclusiones

Los inhibidores de la HDAC han surgido como una nueva clase importante de terapéutica contra el cáncer. Aunque poseen potentes efectos citotóxicos y apoptóticos por sí solos, se prevé que serán más útiles cuando se utilicen en combinación con otras modalidades oncológicas. Esto se refleja en la mayoría de los ensayos clínicos actuales, en los que predominan las combinaciones de inhibidores de HDAC con quimioterapias convencionales y radioterapia. Una cuestión importante en este campo es si los compuestos selectivos de clase o específicos de isoforma tendrán una mayor eficacia terapéutica que los clásicos inhibidores de HDAC de amplio espectro. Los inhibidores de HDAC de amplio espectro tienen efectos anticancerígenos pleiotrópicos, lo que puede ser ventajoso dada la heterogeneidad y adaptabilidad de las células malignas. Por otro lado, los compuestos selectivos por clase o isoforma pueden ofrecer una mayor ventana terapéutica con menores efectos fuera del objetivo. En la actualidad se está llevando a cabo un intenso esfuerzo de investigación para comprender mejor la función de las enzimas HDAC, y cada vez se dispone de más compuestos específicos. Por lo tanto, se prevé que se aclare la cuestión de la selectividad, abriendo quizás más oportunidades para la traducción clínica de esta clase de compuestos.

Conflicto de intereses

Tanto K. Ververis como T. C. Karagiannis declaran que no tienen ninguna relación financiera directa con las identidades comerciales mencionadas en este artículo que pueda dar lugar a un conflicto de intereses.

Agradecimientos

Se agradece el apoyo del Instituto Australiano de Ciencia e Ingeniería Nuclear. T. C. Karagiannis ha recibido premios de la AINSE. El Laboratorio de Medicina Epigenómica cuenta con el apoyo del Consejo Nacional de Salud e Investigación Médica de Australia. K. Ververis cuenta con el apoyo de una beca de postgrado Baker IDI. Este trabajo fue apoyado en parte por el Programa de Apoyo a la Infraestructura Operativa del Gobierno de Victoria. Los autores desean agradecer el uso de las instalaciones proporcionadas por Monash Micro Imaging en el AMREP y, en particular, la asistencia experta de los doctores Stephen Cody e Iśka Carmichael.