Principio del ensayo ELISpot

Los ensayos ELISpot emplean la técnica de ensayo inmunoenzimático (ELISA) en sándwich. Un anticuerpo monoclonal o policlonal específico para el analito elegido se recubre previamente en una microplaca de PVDF (difluoruro de polivinilideno). Se pipetean células adecuadamente estimuladas en los pocillos y se coloca la microplaca en un incubador de CO2 humidificado a 37 °C durante un periodo de tiempo determinado. Durante este periodo de incubación, el anticuerpo inmovilizado, en las inmediaciones de las células secretoras, se une al analito secretado. Después de lavar las células y las sustancias no unidas, se añade a los pocillos un anticuerpo policlonal biotinilado específico para el analito elegido. Tras un lavado para eliminar cualquier anticuerpo biotinilado no unido, se añade fosfatasa alcalina conjugada con estreptavidina. La enzima no unida se elimina posteriormente por lavado y se añade una solución de sustrato (BCIP/NBT). Se forma un precipitado de color azul-negro que aparece en forma de manchas en los lugares de localización de las citocinas, y cada mancha individual representa una célula individual que segrega el analito. Las manchas pueden contarse con un sistema de lectura ELISpot automatizado o manualmente, utilizando un estereomicroscopio.