Origen de la fuerza electroforética sobre el ADN en nanoporos de estado sólido

El transporte de macromoléculas impulsado por la tensión a través de nanoporos biológicos6,7 y artificiales8,9,10,11,12 proporciona un sistema ideal para estudiar la física del proceso de translocación13. La migración electroforética es la principal fuerza impulsora de la translocación del ADN a través de los nanoporos y es consecuencia de la fuerza ejercida por un campo eléctrico aplicado externamente sobre las cargas de la cadena polielectrolítica. Como el ADN en solución está cargado negativamente, es apantallado por una capa de contraiones más o menos móviles y cargados positivamente que también experimentan el campo eléctrico. Desde hace tiempo se sabe que la fuerza ejercida sobre los contraiones induce una fuerza de arrastre hidrodinámica sobre el ADN que equilibra localmente la fuerza eléctrica, dando lugar a una migración mucho más lenta de lo que cabría esperar por el mero arrastre de Stokes (véase, por ejemplo, la ref. 1). La translocación electroforética de un polímero a través de un pequeño poro obedece a principios similares, pero aquí se espera que la geometría del poro (o la estructura local del gel) influya profundamente en el perfil de flujo hidrodinámico alrededor del ADN y, por tanto, en la fuerza de arrastre que se opone al movimiento1,5,14. A pesar de los experimentos cada vez más sofisticados3,12,15,16, todavía no se ha informado de una manifestación inequívoca de las interacciones hidrodinámicas en la translocación del ADN. Aquí, abordamos esta cuestión utilizando nuestro aparato recientemente desarrollado que combina nanoporos de estado sólido con pinzas ópticas3 para detener la translocación del ADN, y posteriormente medir la fuerza de estancamiento en una sola hebra de ADN (véase la sección de Métodos). En la Fig. 1a se muestra un diagrama esquemático del aparato de medición.

a, Diagrama esquemático del aparato de medición. Utilizando pinzas ópticas, se estanca la translocación del ADN y se mide la fuerza sobre el mismo. La conductancia iónica del nanoporo también se mide simultáneamente. b, Modelo cilíndrico de ADN en un nanoporo. Las flechas azules a ambos lados del ADN representan esquemáticamente la velocidad del fluido en movimiento debido a la electroósmosis.

En contraste con un experimento de electroforesis en gel, el campo eléctrico en un experimento de nanoporos está confinado a la vecindad inmediata del poro y las fuerzas eléctricas actúan localmente en un segmento corto del ADN. La intensidad del campo eléctrico en el poro suele alcanzar ∼106 V m-1 debido a que las membranas libres son muy finas (∼60 nm). La gran longitud de persistencia del λ-ADN, de unos 50 nm, garantiza que el segmento de ADN dentro del poro se extienda prácticamente en su totalidad. La situación se representa esquemáticamente en la Fig. 1b, donde L y R representan la longitud y el radio del poro y ΔV es el potencial aplicado. El ADN tiene una densidad de carga lineal desnuda λbare=-0,96 nC m-1 (2 electrones por par de bases) y se modela aquí como un cilindro cargado uniformemente con radio a=1,1 nm. La fuerza electrostática desnuda sobre la espina dorsal del ADN está representada por Fbare=λbareΔV (ref. 3). A ella se opone una fuerza de arrastre Fdrag causada por el movimiento electroforético de sus contraiones en la dirección opuesta: Fdrag es, por tanto, un componente intrínseco del proceso de translocación que, en última instancia, también es atribuible a las fuerzas eléctricas5. La fuerza neta resultante es la fuerza electroforética que impulsa la translocación, dada por Felec=Fbare-Fdrag. En nuestro caso, Felec se equilibra con una fuerza mecánica opuesta Fmech=-Felec de las pinzas ópticas que detiene el ADN dentro del poro.

El origen de Fdrag radica en la distribución espacial de los iones y el correspondiente perfil de flujo del fluido. Una descripción de campo medio de las distribuciones de iones viene dada por el formalismo de Poisson-Boltzmann, en el que el potencial electrostático viene dado por y las correspondientes distribuciones de iones como . Aquí, λD es la longitud de Debye, es el potencial electrostático reducido, e es la carga elemental, Φ es el potencial, kB es la constante de Boltzmann, T es la temperatura, n es la densidad numérica de iones y z es la valencia de la especie iónica. La figura 2a muestra los potenciales calculados para dos tamaños de poro obtenidos mediante la evaluación numérica de la ecuación de Poisson-Boltzmann en una geometría cilíndrica (véase la sección Métodos). Las correspondientes distribuciones de iones se muestran en la Fig. 2b. La capa de Debye del ADN se caracteriza por un agotamiento de los coiones, mientras que los contraiones se apilan a densidades muy altas debido a la alta carga del ADN. Como estas distribuciones son soluciones a la ecuación completa (no linealizada) de Poisson-Boltzmann, se incluye el efecto de la condensación de Manning17.

a, Potencial electrostático reducido para un poro «grande» (verde, R=10 nm) y un poro «pequeño» (azul, R=3 nm). La línea gris indica la ubicación de la pared del poro para el poro pequeño. La concentración de sal es cbulk=20 mM (λD=2,2 nm) y las paredes de los poros se toman como no cargadas en este cálculo particular para simplificar. b, Distribuciones de iones correspondientes. En los poros ‘grandes’ (R≫λD), la distribución de iones alrededor del ADN no se ve afectada significativamente por la pared del poro, como indica la observación de que las curvas verdes alcanzan el valor del volumen. Sin embargo, en los poros «pequeños» (R≲λD), la nube de contraiones (curvas sólidas) es comprimida por la pared del poro y éste puede quedarse sin coiones (curvas discontinuas), dejando principalmente contraiones positivos para equilibrar las cargas negativas del ADN. Esta situación se ejemplifica con las curvas azules. c, Perfiles de velocidad del fluido calculados combinando los resultados de a y b con la ecuación de Stokes. d, Integral superficial normalizada del esfuerzo cortante en cada posición r, calculada como , siendo τ el esfuerzo cortante en el fluido. En la superficie del ADN, . e, Potenciales superficiales reducidos calculados para el ADN (rojo) y la pared del nanoporo (gris) en función del radio del poro. La zona gris representa cualitativamente la región del «poro pequeño», en la que las distribuciones de iones están influidas por el confinamiento del nanoporo.

En nuestro experimento de estancamiento del ADN, la distribución de los contraiones determina en gran medida el perfil de velocidad del flujo electro-osmótico inducido. El perfil de velocidad del flujo puede calcularse resolviendo la ecuación de Stokes , donde η es la viscosidad dinámica del fluido, vz es la velocidad del fluido, Ez es el campo eléctrico aplicado y ρ(r) es la distribución de la carga iónica. Los perfiles de flujo de fluido calculados se muestran en la Fig. 2c. Posteriormente, para relacionar el perfil de flujo con el arrastre viscoso, el esfuerzo cortante en el fluido se calcula como τ(r)=-η(dvz/dr). La figura 2d muestra , que es igual a la relación Fdrag/Fbare cuando se evalúa en la superficie del ADN (r=a). Muestra que Fdrag es del mismo orden de magnitud que la fuerza electrostática desnuda que actúa sobre el ADN al que se opone. Fdrag es mayor para el poro más grande, lo que corresponde a una fuerza de estancamiento menor.

Para la comparación con nuestros experimentos, es conveniente expresar el modelo anterior en una forma que relacione directamente la fuerza electroforética con las propiedades del nanoporo. Como se demostró anteriormente5, las ecuaciones de Poisson-Boltzmann y Stokes pueden combinarse para obtener una expresión para la fuerza electroforética sobre una molécula estacionaria,

Φ(a) y Φ(R) son los potenciales de superficie del ADN y del nanoporo, respectivamente, y ε es la constante dieléctrica del agua. Los valores y deducidos de la ecuación de Poisson-Boltzmann se representan en la Fig. 2e en función de R. En poros grandes, los potenciales de superficie son independientes de R. La ecuación (1) predice entonces que la fuerza medida Fmech tiene una simple dependencia ln-1(R/a) del tamaño del poro. Por otro lado, en los poros más pequeños, la capa de Debye es comprimida por la pared del poro (Fig. 2). Esto da lugar a una dependencia de los potenciales superficiales del tamaño del poro y a una dependencia correspondientemente más complicada de Fmech con respecto a R.

Una forma de probar directamente el modelo anterior es medir la fuerza de estancamiento del ADN Fmech en función del radio del poro R. Sin embargo, como los trabajos anteriores se han centrado en poros más pequeños, primero demostramos que es posible detectar la presencia de una sola molécula de ADN en nanoporos muy grandes (R≫a). La detección del ADN en el poro se basa en la medición del paso de la conductancia iónica ΔG cuando el ADN entra en el poro. Anteriormente se demostró que ΔG se debe a la competencia entre dos contribuciones: la exclusión de volumen, que disminuye el número de iones disponibles para la conductancia, y un exceso de contraiones de ADN, que aumenta efectivamente el número de iones disponibles para la conductancia12. Cuál de estos dos efectos domina depende de la concentración global del electrolito, lo que hace que la ΔG sea positiva (aumento de la conductancia) en los presentes experimentos con 20-50 mM de sal. Bajo estas condiciones optimizadas de sal, se predice que la relación señal/ruido de la captura de ADN es alta incluso en poros muy grandes18. En la Fig. 3a se muestra un paso típico en la corriente junto con el correspondiente cambio en la posición Z de la perla. Observamos un claro paso en la corriente a pesar de que el ADN cambia la conductancia del nanoporo en menos de un 1%. En la Fig. 3b se muestra un histograma típico de eventos de captura. Estos datos muestran que somos capaces de insertar y detectar de forma controlable moléculas individuales incluso en nanoporos con R=45 nm, donde el ADN cubre sólo 1/2000 del área de la sección transversal del nanoporo.

a, Ejemplo típico de la corriente de poro I (panel superior, promediado en rojo) y la posición de la perla Z (panel inferior) durante la captura de ADN en un poro de R=39 nm en 33 mM KCl a 80 mV. Las mediciones de corriente se filtraron por paso bajo a 1 kHz. b, Histograma de ΔG de 88 capturas de ADN en el nanoporo en las mismas condiciones que en a. c, ΔG en poros de diferentes radios. Los eventos de captura ocurrieron típicamente a voltajes de 60-100 mV. La línea horizontal discontinua es una guía para el ojo. Triángulos: 20 mM KCl, estrellas: 33 mM KCl, diamantes: 50 mM KCl, estrella verde: datos de b, barras de error: desviación estándar evaluada a partir de los histogramas de ΔG. Los símbolos abiertos representan datos de experimentos de translocación libre sin pinzas ópticas.

Los valores de ΔG determinados experimentalmente en función del radio del nanoporo se muestran en la Fig. 3c para 10 nanoporos con radios que van de R=3 a 45 nm. La zona gris indica la región del «poro pequeño» en la que, según los cálculos de la Fig. 2b, las distribuciones de iones cerca del ADN están influidas por la presencia de la pared del nanoporo. En aparente coincidencia con las simulaciones, ΔG es aproximadamente constante en los nanoporos grandes. La mayor ΔG en los nanoporos pequeños es consistente con la compresión de la capa de cribado difusa, asegurando la neutralidad de la carga en el poro. Sin embargo, una comparación más cuantitativa de la ΔG medida con la teoría es difícil: la resistencia de acceso Racc se convierte en una contribución cada vez más importante a la resistencia total del sistema en los poros grandes19, y actualmente se desconoce cómo afecta a Racc la presencia de ADN enhebrado a través del poro.

Habiendo establecido la viabilidad de la detención y detección de moléculas de ADN en poros tanto grandes como pequeños, pasamos ahora al resultado principal de esta carta, a saber, la magnitud determinada experimentalmente de la fuerza de detención Fmech en función del radio del nanoporo R. La figura 4a muestra Fmech en función del voltaje aplicado ΔV en nanoporos con R=4 nm (panel izquierdo) y R=39 nm (panel derecho). Esta relación es aproximadamente lineal en ambos casos. Sin embargo, Fmech/ΔV en el poro pequeño es un factor de dos más grande que en el poro grande. La figura 4b muestra la relación Fmech/ΔV en función del tamaño del poro: Fmech/ΔV disminuye gradualmente con el aumento del tamaño, como se esperaba sobre la base de la ecuación (1). La curva discontinua resulta de la combinación de los potenciales de superficie para la carga completa del ADN (Fig. 2e) con la ecuación (1), sin ningún ajuste adicional. A pesar de las simplificaciones inherentes a un modelo unidimensional, el resultado teórico capta bastante bien la tendencia de los datos, aunque sobreestima cuantitativamente la fuerza de estancamiento en ∼50%. Esta diferencia puede atribuirse a (una combinación de) varios factores, incluyendo una reducción de la movilidad de los contraiones en la superficie del ADN12,20, o un flujo de fluido electro-osmótico adicional resultante de las cargas fijas en la superficie del nanoporo5. En términos de la ecuación (1), ambos efectos pueden representarse disminuyendo la magnitud de la diferencia de potencial superficial ΔΦ=Φ(a)-Φ(R), reduciendo así la magnitud de Fmech. La reducción empírica de ΔΦ en un 33% da como resultado la curva sólida de la Fig. 4b, un excelente ajuste a los datos experimentales. Esta reducción de ΔΦ equivale a que aproximadamente el 50% de la carga desnuda del ADN es apantallada por iones que están efectivamente inmovilizados en su superficie (como se muestra en la Fig. Suplementaria S1) o a la presencia de una carga superficial de 15 mC m-2 en la pared del poro (Fig. Suplementaria S2). Aunque nuestro experimento no puede distinguir directamente entre estos dos mecanismos, la densidad de carga superficial inferida es típica de las superficies de SiO221. Esto sugiere que la densidad de carga superficial en nuestros nanoporos no está fuertemente influenciada por el proceso de fabricación y que la carga del poro es responsable de una parte sustancial de la corrección observada.

a, Mediciones de la fuerza de estancamiento en función del potencial aplicado en un nanoporo pequeño (panel izquierdo) y uno grande (panel derecho). En cada caso, se muestran dos mediciones obtenidas a diferentes distancias entre la perla y el nanoporo. b, Fuerza medida en función del radio del poro. Los símbolos azules y verdes corresponden a los datos de a. Los datos de la zona de poros pequeños se tomaron de la ref. 3. Las curvas representan el resultado teórico para la carga de ADN desnuda (curva discontinua) y para una ΔΦ reducida (línea sólida, ver texto). El recuadro muestra de forma esquemática cómo la fuerza sobre los contraiones de ADN se divide entre el ADN y las paredes del poro a través del arrastre viscoso en un poro pequeño y uno grande; la flecha amarilla representa la fuerza electrostática desnuda que actúa sobre el ADN. Triángulos: 20 mM KCl, estrellas: 33 mM KCl, diamantes: 50 mM KCl. Las barras de error provienen de las incertidumbres en la calibración de la trampa óptica, que se estiman en un 10-30% de la rigidez de la trampa calibrada.

Factores externos no tenidos en cuenta en nuestro modelo simple podrían afectar también al valor absoluto de la fuerza de estancamiento. Por ejemplo, podría estar sesgada por fuerzas electrostáticas y/o hidrodinámicas en la perla o en la parte del ADN que reside en el campo eléctrico justo fuera del nanoporo. Sin embargo, nuestros experimentos no muestran ninguna evidencia de tales efectos, ya que no detectamos ningún cambio en la fuerza de estancamiento cuando la perla se colocó a distancias crecientes del nanoporo3. Además, las curvas experimentales de fuerza-voltaje son lineales en nuestro rango de voltaje (Fig. 4a), lo que indica que las fuerzas entrópicas son pequeñas en comparación con las fuerzas electrostáticas, lo que concuerda con las mediciones independientes de las fuerzas entrópicas en el estiramiento del ADN22.

La dependencia de la fuerza medida del radio del poro en la Fig. 4b demuestra directamente que la fuerza electroforética en la translocación del ADN está determinada en parte por el acoplamiento hidrodinámico entre los contraiones del ADN y la pared del nanoporo. La geometría del nanoporo determina la magnitud de la fuerza de arrastre ejercida sobre el ADN por estos contraiones. Este acoplamiento tiene importantes consecuencias para la interpretación de las fuerzas determinadas experimentalmente, ya que estas fuerzas no están determinadas por las propiedades intrínsecas del ADN por sí solas1,23.

También se pueden esperar variaciones de la fuerza con el aumento de la concentración de sal, ya que esto cambia la longitud de Debye y, por lo tanto, tanto el potencial de superficie del ADN como, presumiblemente, la fuerza de estancamiento Fmech. Sin embargo, esta expectativa se complica por el hecho de que la densidad de carga de la superficie de los poros también cambia considerablemente con la concentración de sal12 y que la teoría del campo medio utilizada aquí se vuelve poco fiable a una fuerza iónica elevada. En experimentos anteriores, se encontró que Fmech era independiente de la concentración de sal hasta 1 M (ref. 3), y una interpretación de esos datos basada en un modelo en el que Φ(R) depende de la concentración de sal fue sugerida por Ghosal5.

En la translocación libre del ADN, la fuerza restauradora Fmech está ausente y es efectivamente reemplazada por un arrastre extra de Stokes FStokes proporcional a la velocidad de la molécula. La molécula se transloca a velocidad constante, la fuerza electroforética se equilibra con FStokes. La relación entre la fuerza de estancamiento Fmech, medida con las pinzas ópticas, y la velocidad de translocación vtrans, determinada a partir de experimentos de translocación de ADN libre, viene dada por4,5,14

Este resultado es equivalente al arrastre de Stokes que experimentaría un cilindro sin carga translocándose a través de un poro cilíndrico a velocidad constante vtrans. Así, Fmech y vtrans son cantidades proporcionales, relacionadas por un factor dependiente de la geometría. Esta expectativa se ve cualitativamente confirmada por los datos experimentales3,12, que muestran que Fmech y vtrans son, de hecho, aproximadamente proporcionales. Si se calcula vtrans como la longitud del contorno del λ-ADN dividida por el tiempo de translocación determinado experimentalmente, se obtiene vtrans=(16 μm/1,1 ms)≈15 mm s-1, lo que resulta en Fmech/vtrans=1.750 pN s m-1 (datos para poros de 5 nm de radio). Sin embargo, la ecuación (2) da un valor de 249 pN s m-1 para este factor, utilizando η=1×10-3 N s m-2, L=60 nm, R=5 nm y a=1,1 nm. Esto es siete veces menor que el valor obtenido experimentalmente. La translocación del ADN a través de estos poros se produce, por tanto, a una velocidad mucho menor que la esperada a partir de las fuerzas electroforéticas medidas con las pinzas ópticas y la descripción del campo medio. Como en todos estos experimentos se utilizaron nanoporos similares, esta conclusión apunta a una diferencia más fundamental entre la situación estática de una molécula estancada y la situación dinámica de una molécula en translocación. En la translocación libre del ADN, la conformación del ADN fuera del poro resulta en un arrastre extra sobre la molécula en movimiento24, lo que puede explicar la discrepancia.

En conclusión, hemos demostrado que la fuerza electroforética sobre una molécula de ADN en un nanoporo depende de la geometría del poro. Esto no se espera a partir de la simple electrostática, pero puede entenderse directamente si se considera el arrastre hidrodinámico inducido por los contraiones que tamizan el ADN en solución. Los cálculos numéricos basados en las ecuaciones de campo medio proporcionan una buena descripción de la dependencia del tamaño del poro de las fuerzas medidas.