La electroacupuntura atenúa el estrés oxidativo hepático y renal en ratas anestesiadas

13 -ARTÍCULO ORIGINAL
METABOLISMO

La electroacupuntura atenúa el estrés oxidativo hepático y renal en ratas anestesiadas1

La electroacupuntura atenúa el estrés oxidativo en el hígado y en el riñón en ratas anestesiadas

Agamenon Honório SilvaI; Lanese Medeiros FigueiredoI; Paulo Araujo DiasI; Alberico Ximenes do Prado NetoII; Paulo Roberto Leitão de VasconcelosIII; Sérgio Botelho GuimarãesIV

Maestría en el Departamento de Cirugía, Programa de Postgrado, UFC, Ceará, Brasil. Procedimientos técnicos, adquisición e interpretación de datos. El artículo es parte de una disertación de maestría (AHS)
IIG Estudiante de posgrado, UFC, Ceará, Brasil. Ayudó con los procedimientos técnicos, adquisición de datos
IIIPhD, Profesor Asociado, Coordinador, Programa de Postgrado, Departamento de Cirugía, UFC, Ceará, Brasil. Revisión crítica e interpretación de datos
IVPhD, Profesor Asociado, Departamento de Cirugía, Jefe, LABCEX, UFC, Ceará, Brasil. Tutor, concepción, diseño, contenido intelectual y científico del estudio, redacción del manuscrito, análisis estadístico

Correspondencia

ABSTRACT

Finalidad: Investigar los efectos de una única sesión de electroacupuntura (EA) en los puntos de acupuntura Zusanli (ST-36) y Zhongwan (CV-12) combinados en la regulación del estrés oxidativo en hígado y riñón en ratas anestesiadas.
METODOS: Dieciocho ratas sanas asignadas aleatoriamente a 3 grupos (n=6) fueron anestesiadas por vía intraperitoneal con ketamina (90mg kg-1 peso corporal) + xilacina (10mg/kg peso corporal): G-1: Control (anestesia), G-2: anestesia+EA10Hz y 10 mA, 10 Hz) aplicados a los acupuntos ST-36 y CV-12 derechos durante 30 minutos. El G-3 fue tratado igualmente, utilizando una frecuencia diez veces mayor (100 Hz). La actividad de la G6PDH, el malondialdehído (MDA) y los niveles de glutatión (GSH) se analizaron espectrofotométricamente.
RESULTADOS: Las concentraciones de MDA y GSH en el hígado aumentaron significativamente en las ratas sometidas a EA 10Hz (p<0,01) y EA 100Hz (p<0,001), en comparación con el control G-1. La actividad de G6GPH en hígado y riñón disminuyó significativamente en G-2 (p<0,01) y G-3 (p<0,001) en comparación con G-1 en ratas sometidas a EA100Hz. Se encontró un patrón similar en la actividad G6PDH renal en las ratas EA10Hz.
CONCLUSIÓN: Una única sesión de 30 minutos de EA 10/100Hz mejora la peroxidación lipídica y reduce simultáneamente el estrés oxidativo en los tejidos hepáticos y renales en un modelo de rata.

Palabras clave: Acupuntura. Electroacupuntura. Peroxidación lipídica. Estrés oxidativo. Rats.

RESUMO

OBJETIVO: Investigar los efectos de una única sesión de eletroacupuntura (EA) aplicada en los acupontos Zusanli (E-36) y Zhongwan (RM-12) simultáneamente, en la regulación del estrés oxidativo en el hígado y los riñones en ratas anestesiadas.
METODOS: Dieciocho ratas sanas, distribuidas aleatoriamente en tres grupos (n = 6), fueron anestesiadas con ketamina (90mg/kg de peso corporal) + xilacina (10mg/kg de peso corporal): G-1: Control (anestesia), G-2: anestesia + EA10Hz y G-3: anestesia + EA100Hz. Las ratas del grupo G-2 fueron sometidas a EA (ondas cuadradas pulsadas, 10 mA, 10 Hz) aplicadas a los acupuntos ST-36 y VC-12 derechos durante 30 minutos. En las ratas del grupo G-3 se utilizó una frecuencia 10 veces superior (100 Hz). La actividad de la enzima G6PDH y las concentraciones de malondialdehído (MDA) y glutatión (GSH) se comprobaron por espectrofotometría.
RESULTADOS: Las concentraciones hepáticas de MDA y GSH aumentaron significativamente en las ratas sometidas a EA utilizando 10Hz (p <0,01) y 100Hz (p <0,001), en comparación con el control. La actividad de la G6GPH disminuyó significativamente en el G-2 (p <0,01) y el G-3 (p <0,001) en el hígado y el riñón en comparación con el grupo G-1 en las ratas tratadas con 100Hz.
CONCLUSIÓN: Una única sesión de EA de 10/100Hz durante 30 minutos aumenta la peroxidación lipídica y reduce simultáneamente el estrés oxidativo en el hígado y el riñón de ratas sanas.

Descriptores: Acupuntura. Electroacupuntura. Peroxidación de lípidos. Estrés oxidativo. Ratas.

Introducción

La acupuntura manual (AM) es una de las principales formas de tratamiento en la medicina tradicional china. Consiste en el uso de agujas finas y afiladas que se introducen en el cuerpo en puntos muy concretos (acupuntos). La AM se utiliza desde hace varios milenios en los países orientales y es cada vez más aceptada por los médicos y los pacientes también en Occidente1. La electroacupuntura (EA) es una modificación de esta técnica en la que se aplican pequeñas corrientes eléctricas a las agujas previamente insertadas en el cuerpo y parece tener resultados más consistentes y reproducibles en muchos entornos clínicos y de investigación específicos2-4. La EA aplicada al acupoint Zusanli (ST-36) redujo la peroxidación lipídica en modelos experimentales de isquemia/reperfusión como la médula espinal de rata5, el cerebro6 y el suero sanguíneo7 y el músculo cardíaco de cerdo8.

Chakrabarti et al.9 investigaron el efecto de un tratamiento de electroacupuntura único, agudo (7 pulsos/seg., 0,75 voltios) y crónico (4 pulsos/seg., 0,75 voltios) en días alternos durante un período de 21 días sobre las funciones hepáticas de las ratas. Se utilizaron dos acupuntos de la espalda junto con el ST-36. Tras el tratamiento crónico, el valor de la peroxidación lipídica microsomal del hígado disminuyó significativamente. Además, dado que la estimulación manual del acupoint ST-36 es capaz de atenuar la lesión renal inducida por la sepsis10, es posible que la estimulación eléctrica de ese acupoint pueda alterar las concentraciones de MDA, un indicador de lesión de la membrana celular, en el tejido renal.

Los procesos fisiológicos están regulados por enzimas. El NADPH es el principal reductor intracelular y su producción depende principalmente de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa. Si se inhibe la actividad de la G6PDH, se produce una disminución simultánea de la actividad del NADPH, una coenzima esencial para la protección contra el daño oxidativo. La integridad de las células, así como todo el sistema antioxidante, dependen del suministro adecuado de NADPH11. Muchos trabajos han demostrado los efectos de la MA y la EA en el acupoint ST-36 en la atenuación del estrés oxidativo en diferentes enfermedades experimentales5-9. Además, el uso de ketamina+xilazina, una mezcla anestésica utilizada a menudo en estudios experimentales, puede inducir cierto grado de estrés oxidativo en un animal sano12-13.

Se ha demostrado previamente que se secretan grandes cantidades de péptidos opioides endógenos desde las glándulas suprarrenales cuando se estimulan los acupuntos CV-12 mediante acupuntura con 2Hz14. Cuando se aplicó una EA de alta frecuencia (15 Hz) para estimular el acupoint CV-12, se descubrieron múltiples fuentes de péptidos opioides endógenos15. Por lo tanto, nos propusimos investigar si la aplicación de EA, estimulando tanto el acupoint ST36 como el CV-12, utilizando dos frecuencias diferentes, 10 Hz y 100 Hz, puede modificar el contenido de MDA y GSH del hígado y el riñón y si hay una diferencia en la peroxidación lipídica y el estrés oxidativo entre la EA de 10 Hz y 100 Hz en roedores sanos.

Métodos

Preparación de los animales

Ratas Wistar macho de 280-400 g de peso, proporcionadas por el Centro de Cría de Animales Pequeños de la Facultad de Medicina (Universidad Federal de Ceará) fueron mantenidas en condiciones ambientales controladas (24°C _humedad relativa 40%-60%, ciclos de luz-oscuridad alternados de 12 horas, comida y agua ad libitum). Se eligieron los equivalentes de los acupuntos ST-36 y CV-12 derechos del ser humano para su punción y estimulación eléctrica. La nomenclatura de los puntos de acupuntura utilizada sigue la nomenclatura de la OMS16. El acupoint ST-36 está situado 5 mm por debajo de la cabeza del peroné, bajo la articulación de la rodilla, y 2 mm lateral al tubérculo anterior de la tibia. La punción del acupoint ST-36 estimula el nervio cutáneo sural lateral, la rama cutánea del nervio safeno y, más profundamente, el nervio peroneo profundo17-18. El acupoint CV-12 está situado en la línea media anterior del abdomen superior, 20 mm por debajo de la sincondrosis esternal. Esta región está inervada por la rama cutánea anterior del 8º nervio intercostal18.

Materiales

Se utilizaron agujas desechables de acero inoxidable (0,20×30 mm, 0,5 cm, DongBang Acupuncture Inc., Chung Nam, Corea). El electroestimulador EL-608 se compró a NKL Produtos Eletrônicos Ltda., Brusque, Santa Catarina, Brasil.

Grupos experimentales

Los animales fueron anestesiados por vía intraperitoneal con una mezcla preparada en fresco de ketamina (90mg kg/peso corporal) y xilacina (10mg kg/peso corporal). Las ratas se asignaron aleatoriamente a 3 grupos iguales, como se indica a continuación:

* Grupo 1 (anestesia) – 6 ratas

* Grupo 2 (EA 10Hz) – 6 ratas

* Grupo 3 (EA 100Hz) – 6 ratas

Las ratas del Grupo 1 (Control) fueron anestesiadas como se describe. Sesenta minutos después, se abrió el abdomen de las ratas y se extrajeron el hígado y los riñones derechos. Las ratas del Grupo 2 (EA10Hz) fueron anestesiadas como se ha descrito. Tras la desinfección rutinaria de la piel con etanol al 75%, se insertaron agujas desechables de acero inoxidable (0,25 mm × 30 mm) perpendicularmente a una profundidad de 2-3 mm en los puntos de acupuntura ST-36 y CV-12 derechos. Se conectaron electrodos a ambas agujas y a un electroestimulador (NKL EL-608); se aplicaron ondas cuadradas pulsadas, 10 Hz, 10 mA durante 30 minutos. Las muestras se recogieron 30 minutos después. Las ratas del Grupo 3 (EA100Hz) fueron sometidas a EA como el Grupo 2. Sin embargo, se utilizó una frecuencia diez veces mayor (100 Hz).

Determinaciones bioquímicas

Los parámetros determinados incluyeron la actividad de la G6PDH, las concentraciones de malondialdehído (MDA) y de glutatión (GSH). Las muestras de tejido se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron en tubos de vidrio a -70º hasta la posterior preparación y análisis de los homogeneizados de hígado y riñón. La peroxidación de los lípidos se analizó midiendo el malondialdehído como sustancias reactivas al TBA19. En resumen, se añadió H3PO4 (1%, 3 mL) y una solución acuosa de TBA (0,6%, 3 mL) al homogenado al 10% (0,5 mL). El medio de ensayo se agitó y se calentó en un baño de agua hirviendo durante 45 minutos. Después de enfriar, se añadieron 4 mL de n-butanol y se agitó la mezcla. Tras la separación de la capa de n-butanol por centrifugación a 1200g durante 15 min, se determinó su densidad óptica en un espectrofotómetro (Beckman DU 640 B; Beckman Instruments, ahora Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, USA) con 535 y 520 nm como longitudes de onda de absorción, respectivamente. La diferencia entre los resultados de las dos determinaciones de densidad óptica se tomó como valor de TBA y se calculó la cantidad de malondialdehído (MDA) en los testículos, comparándola con los estándares de MDA y expresándola como micromoles de MDA por gramo de tejido húmedo. Los niveles de GSH se estimaron mediante el método de Sedlak y Lindsay20 , que se basa en la reacción entre los grupos tiol y el ácido 5-5-ditiobis-(2-nitrobenzoico) para producir un compuesto que absorbe la luz a 412 nm. La cantidad de GSH se determinó a partir de una curva estándar obtenida simultáneamente en las mismas condiciones con diversas concentraciones de GSH. Las actividades de la G6PDH se estimaron por métodos descritos previamente21. La actividad enzimática se leyó espectrofotométricamente.

Análisis de datos

Se utilizó Graphpad Prism 5.0 (GraphPad Software, San Diego California USA, www.graphpad.com) para el cálculo y el análisis estadístico. Todos los resultados se expresaron como media±SD. Se comprobó la distribución de todos los datos (prueba de Kolmorogov-Smirnov con valor P de Dallal-Wilkinson-Lilliefor). Se realizó un ANOVA de una vía o la prueba de Kruskal-Wallis, según fuera necesario, para determinar las diferencias entre los grupos en las concentraciones de MDA y GSH y la actividad de la G6PDH en los tejidos hepáticos y renales. En el análisis post hoc (Tukey o Dunn), se consideró que un valor de probabilidad de p<0,05 indicaba significación estadística.

Resultados

Ensayo de GSH

Las concentraciones de GSH en hígado aumentaron significativamente en las ratas sometidas a EA 10Hz y EA 100Hz (p<0,001), en comparación con el control (Figura 1). Se produjeron aumentos similares en las concentraciones renales de GSH en los grupos de EA10Hz y EA100Hz (Figura 2). Además, las concentraciones de GSH de hígado y riñón aumentaron significativamente en las ratas tratadas con EA100Hz en comparación con el grupo de EA10Hz.

Ensayo de MDA

Las concentraciones de MDA de hígado aumentaron significativamente en las ratas sometidas a EA10Hz (p<0,01) y EA100Hz (p<0,001), en comparación con el grupo de control (Figura 3). Se produjeron aumentos similares en las concentraciones de MDA renal en los grupos de EA10Hz y EA100Hz (Figura 4). Las concentraciones de MDA renal aumentaron significativamente en el grupo de EA100Hz en comparación con el grupo de EA10Hz.

Ensayo de G6PDH

La actividad de G6GPH hepática disminuyó significativamente en los grupos de EA100Hz (p<0,001) en comparación con el grupo de control (Figura 5). Se encontró un patrón similar en la actividad G6PDH renal en las ratas EA10Hz. La actividad de la G6PDH renal no fue diferente en ambos grupos (Figura 6).

Discusión

En nuestro experimento el estrés oxidativo fue inducido por el uso de ketamina, un agente anestésico disociativo, utilizado a menudo durante procedimientos veterinarios o con fines experimentales. Alva et al.12 demostraron que la ketamina provoca un aumento de los niveles de óxido nítrico plasmático, induce acidosis metabólica y causa daño oxidativo, aunque sin llegar a la toxicidad hepática.

Se han demostrado efectos antioxidativos de la EA de baja frecuencia. Siu et al.6 electroestimularon los acupuntos GB-20, situados en la cara posterior del cuello, por debajo del hueso occipital, en la depresión entre el músculo esternocleidomastoideo y el músculo trapecio y el ST-36, utilizando múltiples aplicaciones antes de la isquemia cerebral y concluyeron que la EA de 2Hz podía regular parcialmente la peroxidación lipídica en la isquemia cerebral. El GB-20 y el ST-36 tuvieron una eficacia beneficiosa similar6. En nuestro estudio, el uso de EA indujo un aumento significativo de la concentración de MDA en el hígado (figura 3) y el riñón (figura 4) en los grupos de EA10Hz y EA100Hz. Se produjo un aumento adicional de la peroxidación lipídica en el grupo EA100Hz en comparación con las ratas EA10Hz. Esto sugiere que el riñón es más susceptible a la peroxidación lipídica que el hígado. Parece que el uso de la estimulación eléctrica utilizando altas frecuencias en una sola sesión aumenta la peroxidación de los lípidos en este modelo de rata.

Yu et al.22 evaluaron el papel de la estimulación con agujas de cuatro acupuntos diferentes: GB-34 (Yanglingquan), LR-3 (Taichong), ST-36 (Zusanli) y SP-10 (Xuehai) en la regulación del estrés oxidativo en el sistema nigroestriatal en la rata lesionada con 6-hidroxidopamina y concluyeron que la estimulación por acupuntura prevenía la reducción del nivel de GSH así como el aumento del nivel de MDA.

Como se estudiaron los efectos de una única sesión de electroacupuntura mientras que en Yu et al.22 evaluaron los efectos del tratamiento clásico de acupuntura, realizado dos veces al día durante 14 días, creemos que el uso de la estimulación eléctrica en una sola sesión podría ser responsable del aumento de los niveles de MDA. Por otro lado, la EA utilizada en una sola sesión indujo un aumento significativo de la concentración de GSH tanto en los tejidos hepáticos (Figura 1) como en los renales (Figura 2). El efecto protector de la EA es mayor a frecuencias más altas, como demuestra el aumento de la concentración de GSH en el riñón de las ratas EA100Hz, en comparación con los animales EA10Hz.

La G6PDH desempeña un papel muy importante en la respuesta celular al estrés oxidativo. Hasta hace poco existía la creencia general de que la importancia de esta enzima se limitaba a los eritrocitos humanos que carecen de cualquier otra vía productora de NADPH23. Observaciones recientes han demostrado que la G6PDH desempeña un papel protector contra las especies reactivas del oxígeno en las células eucariotas que poseen rutas alternativas para la producción de NADPH24. En este estudio, la actividad de la G6PDH disminuyó significativamente en el hígado de los grupos EA10Hz y EA100Hz. Se observó una caída similar de la actividad en el riñón de las ratas EA10Hz. Las concentraciones de GSH en el riñón aumentaron en las ratas EA100Hz al mismo tiempo que se demostró una disminución concomitante de la G6PDH en el mismo grupo.

Yu et al.25 han demostrado que la activación de la G6PDH está inversamente correlacionada con los niveles intracelulares de GSH, utilizando cultivos de suspensión celular de Taxus chinensis. Es posible que las células animales tengan un comportamiento similar.

En cuanto a los puntos fuertes y débiles de este estudio en relación con otros, no hay ningún estudio publicado que pueda compararse directamente con la presente investigación. A pesar de que los efectos peroxidativos de la EA fueron demostrados aquí, en contraste con otros estudios6, la electroestimulación de 10 Hz no fue utilizada por otros investigadores. Los estudios publicados utilizaron EA de baja frecuencia (2 Hz), en múltiples sesiones. En nuestro estudio se utilizó una única sesión. Por otra parte, la disminución de la actividad de la G6PDH en el hígado y el riñón de las ratas tratadas con 100 Hz y 10 Hz, respectivamente, junto con un aumento concomitante de los niveles de GSH, tras una única sesión de EA, sugieren que las frecuencias más altas podrían inducir una mayor protección contra el estrés oxidativo. Los mecanismos implicados no están claros hasta ahora. Otros estudios podrían arrojar nueva luz sobre los efectos protectores de la electroacupuntura.

Conclusión

Los datos recogidos apoyan la hipótesis de que una única sesión de EA 10/100Hz de 30 minutos mejora la peroxidación lipídica y reduce simultáneamente el estrés oxidativo al aumentar los niveles de GSH en los tejidos del hígado y el riñón en un modelo de rata.

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