Infección por Burkholderia cepacia complex en una unidad de fibrosis quística de adultos en Madrid | Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica

Introducción

Burkholderia cepacia complex (BCC) ha surgido como patógeno importante en pacientes con fibrosis quística (FQ) debido al riesgo de síndrome cepacia (una neumonía necrotizante mortal con bacteriemia), la multirresistencia innata del organismo a los antibióticos y la transmisibilidad de las cepas bacterianas entre los pacientes por contacto social.1 El contacto estrecho y prolongado entre pacientes con FQ y el hecho de compartir nebulizadores facilita la adquisición y la transmisión de la BCC.2,3 Está demostrado que la adquisición de la bacteria BCC está asociada a la hospitalización y a la infección cruzada por contacto social FQ.

La taxonomía del género Burkholderia ha sufrido varias revisiones importantes en las últimas décadas. A mediados de los años 90, se demostró que las cepas de «B. cepacia» pertenecían al menos a cinco especies diferentes, que se denominaron colectivamente el complejo B. cepacia.4 Otros análisis taxonómicos revelaron que había incluso más especies dentro del CBC y actualmente se han descrito 17 especies del complejo B. cepacia4-7: B. cepacia, B. multivorans, B. cenocepacia, B. stabilis, B. vietanmiensis, B. dolosa, B. ambifaria, B. anthina, B. pyrrocinia, B. ubonensis, B. latens, B. diffusa, B. arboris, B. seminalis, B. metallica, B. lata y B. contaminans.8

A excepción de B. ubonensis, todas estas especies se han aislado del esputo de pacientes con FQ,6,7 siendo B. cenocepacia y B. multivorans las predominantes.9

B. cenocepacia se subdivide en 4 subtipos (IIIa, IIIb, IIIc y IIId), que están codificados por cuatro alelos del gen recA y existen diferencias en la frecuencia y virulencia de las cepas. Además, B. cenocepacia se considera uno de los patógenos más graves porque se asocia con frecuencia a una menor supervivencia y al mayor riesgo de desarrollar el síndrome cepacia fatal.10 Las especies de BCC son intrínsecamente resistentes a muchos antibióticos, como los aminoglucósidos y la polimixina B, y a menudo requieren una terapia combinada para suprimir la infección en la FQ.11

Las infecciones por bacterias BCC en pacientes con FQ suelen estar correlacionadas con un aumento de la morbilidad y la mortalidad, y la resistencia innata de estos organismos a una amplia gama de antibióticos complica el tratamiento de los pacientes infectados.12,13 Esta resistencia está causada por varios mecanismos, como la permeabilidad limitada, los cambios en la estructura del lipopolisacárido y la presencia de varias bombas de eflujo de fármacos, betalactamasas cromosómicas inducibles y proteínas de unión a la penicilina alteradas. Además, se ha descrito la formación de biopelículas in vitro para múltiples cepas del complejo B. cepacia y esto puede contribuir a su capacidad para sobrevivir en el entorno pulmonar de la FQ, proporcionando una protección adicional frente a los antibióticos.14-16

El tratamiento de los pacientes infectados por CBC debe basarse preferentemente en los resultados de las pruebas de susceptibilidad y a menudo incluye una terapia combinada con dos o tres antibióticos que muestran una actividad sinérgica.12,17,18Los estudios de susceptibilidad in vitro en cepas de CBC muestran que las concentraciones de punto de rotura de ceftazidima, ciprofloxacino, meropenem, tetraciclinas o altas dosis de tobramicina tienen una actividad bacteriostática contra una fracción considerable de estas cepas.19-21 En consecuencia, estos antibióticos se utilizan a menudo para tratar a los pacientes con CBC infectados. Además, el cotrimoxazol se sigue utilizando con frecuencia en el tratamiento de las infecciones crónicas por CBC, aunque las pruebas de sensibilidad de estos antibióticos complementarios revelaron una escasa actividad contra muchas cepas de CBC.18,22

El objetivo de este estudio fue evaluar los aislamientos y la susceptibilidad de CBC y analizar las repercusiones clínicas.

Métodos

Se analizaron los esputos de pacientes con FQ para los aislamientos finales de CBC, en la Unidad de FQ de adultos del Hospital La Princesa que funciona desde marzo de 1997. Estas muestras se procesaron en el servicio de microbiología por el procedimiento estándar23; se utilizó medio selectivo específico y racha cuantitativa, empleando el procedimiento convencional de dilución seriada de la muestra. El esputo se sometió a un proceso de homogeneización con N-acetilcisteína antes de su cultivo. En nuestro laboratorio, los medios de cultivo utilizados fueron: agar sangre, agar chocolate bacitracina, agar manitol-sal, agar MacConkey, agar Sabouraud cloranfenicol y medio selectivo para B. cepacia denominado BCSA (Biomèrieux). El tiempo de incubación de las placas fue de 3 a 5 días a 35°C. El agar chocolate de bacitracina se incubó en atmósfera de CO2.

La identificación preliminar de las cepas de BCC se realizó mediante MicroScan (Siemens) y Api 20 NE (Biomerieux). Estos procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.24

Posteriormente, las cepas fueron remitidas al Centro Nacional de Microbiología (Majadahonda, Madrid) para la confirmación y determinación de la especie y la genoespecie. Para este estudio, se llevaron a cabo los siguientes métodos Api 20 NE (biomerieux, Marcy l’Etoile) y GN2 Microplate (BIOLOG, Hayward, CA) y métodos moleculares. Todos los procedimientos se realizaron según las recomendaciones del fabricante.

Extracción de ADN cromosómico

La extracción de ADN se realizó con el kit comercial QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN, GmbH, Hilden, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Análisis de PCR

La amplificación de los genes se realizó en un volumen final de 25μl, utilizando el kit PuReTaq Ready-To-Go PCR Beads (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, Reino Unido), y conteniendo 5μl de ADN extraído y 10pmol de cada cebador: fD1 y rP225 para el ADNr 16S, y BCR1 y BCR426 para el recA. Los ciclos térmicos se llevaron a cabo en un termociclador TaKaRa PCR v. III mod TP600 (TAKARA BIO Inc., Otsu, Shiga) bajo las siguientes condiciones para el ADNr 16S: 94°C durante 5min para el primer ciclo, 35 ciclos de 15s a 94°C, recocido durante 15s a 55°C, y extensión a 72°C durante 1min y 50s. Las condiciones para la amplificación de recA fueron las siguientes 94°C durante 5min, 30 ciclos de 30s a 94°C, recocido durante 45s a 55°C, y extensión a 72°C durante 10min.

Visualizamos 2μl de cada producto de la PCR mediante electroforesis en gel de agarosa con concentración de agarosa ajustada al 1,5% y utilizando tampón TAE 1×. Se incluyeron marcadores de tamaño molecular en todos los geles: Marker X 0,07-12,2kbp (Roche Applied Sciences, Mannheim, Alemania) y GeneRuler 100bp DNA Ladder (Fermentas GmbH, St. Leon-Rot, Alemania) para los productos 16s rDNA y recA, respectivamente.

Las cepas identificadas como B. cenocepacia se sometieron al método PCR con cebadores específicos para el grupo RecA-IIIA (BCRG3A1 y BCRG3A2) y RecA-IIIB (BCRG3B1 y BCRG3B2) en las condiciones descritas anteriormente.24

Diez μl de los productos de la PCR se visualizaron mediante electroforesis en gel de agarosa en las mismas condiciones descritas anteriormente.

Análisis de la secuencia de nucleótidos

Los productos de la PCR de rDNA y recA se secuenciaron utilizando fD1 y rP2 y BCR1 como cebadores, respectivamente. Las reacciones de secuenciación se prepararon mediante Big Dye Terminator v 3.1 (Applied Biosystem, EE.UU.) en un volumen final de 10μl de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y se analizaron con el sistema de electroforesis capilar ABI PRISM 3100 genetic analyzer (Applied Biosystem, EE.UU.). Las secuencias se ensamblaron con el software SeqMan 3.61 (DNA Star, Inc, Madison, WI, EE.UU.). El análisis también incluyó el uso de la herramienta de búsqueda de alineación local básica (BLAST: www.ncbi.nlm.nih.gov) para establecer la identidad genética correcta.

Análisis de PFGE

La relación de las cepas se analizó mediante electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE). La preparación de los tapones, la lisis, el lavado de las células y la digestión de restricción se realizaron como se ha descrito previamente25,26 con ligeras diferencias. Se utilizó la enzima de restricción XbaI (40U, Fermentas GmbH, St. Leon-Rot, Alemania). La PFGE se realizó siguiendo el protocolo descrito para Stenotrophomonas maltophilia por Valdezate et al.,27 y utilizando el sistema DRIII Chef (Bio-Rad Laboratories, Hercules, EE.UU.) y concámeros de fago lambda (Biolabs, New England, Reino Unido) como marcador de peso molecular. Las imágenes se obtuvieron con el software Quantity One v. 4.6.1 (BioRad). El análisis de las imágenes se realizó visualmente y se consideró que los aislados eran indistinguibles desde el punto de vista genotípico si tenían un patrón de bandas idéntico.

La susceptibilidad a los antibióticos se realizó mediante microdilución con MicroScan y difusión en disco simultáneamente. Ambos métodos se consideraron como puntos de rotura del CLSI.28 Para la ciprofloxacina y el imipenem, se utilizaron los puntos de rotura de la levofloxacina y el meropenem, respectivamente. Se estudiaron los siguientes antibióticos: ceftazidima, ciprofloxacino, levofloxacino, cotrimoxazol, minociclina, imipenem y meropenem.

Los pacientes con CCC fueron estudiados con las siguientes variables: edad (al inicio y en la actualidad), sexo, peso (al inicio y en la actualidad), mutación del gen Regulador Transmembrana de la Fibrosis Quística, evolución de la función respiratoria que se determinó por el porcentaje según valor teórico del volumen espirado en el primer segundo (FEV1) desde su primer aislamiento así como las puntuaciones radiológicas de Brasfield y clínicas de Shawchman al inicio del aislamiento de CCC y en la actualidad.

Se evaluó la cocolonización con otros microorganismos.

La puntuación de Brasfield se evaluó con 0-5 (de bajo a alto) según los signos radiológicos: atrapamiento aéreo, sombras lineales, lesiones quísticas nodulares, consolidación segmentaria o lobar y la impresión global de la gravedad. La puntuación global obtenida se restó a 25. El valor más bajo obtenido correspondía a una radiología más grave. La radiología de tórax y su correspondiente puntuación de Brasfield se realizaron cada año.

Puntuación clínica Shwachman evaluó 4 ítems con una puntuación máxima de 25 cada uno: actividad general, exploración física, crecimiento y nutrición y radiografía de tórax. La puntuación ideal fue 100 y el estado de los pacientes se clasificó según la puntuación: excelente (86-100 puntos), bueno (71-85 puntos), leve (56-70 puntos), moderado (40-55 puntos) o grave (menor o igual a 40).

Resultados

El CBC se aisló en 12 de 70 pacientes adultos con FQ (17,1%) durante 10 años. Dos de los pacientes tuvieron un trasplante de pulmón, uno de ellos murió después del trasplante y el otro, el CBC fue erradicado en 2005 antes del trasplante que fue en 2011. El CBC fue erradicado en otro paciente en 2009. Estos pacientes fueron estudiados sólo durante unos meses, por lo que no se registró la evolución clínica. Se aisló B. cenocepacia en 4 pacientes (33,3%), B. contaminans en 3 pacientes (25%), B. stabilis en 2 pacientes (16,7%), B. vietnamiensis en 2 pacientes (16,7%), B. cepacia en un paciente (8,3%), B. multivorans en un paciente (8,3%) y B. lata en un paciente (8,3%). Entre B. cenocepacia, el subtipo IIIa se identificó en dos pacientes de los 4 (50%), y el subtipo IIIb en los otros dos (50%). Uno de los pacientes tuvo al principio B. cenocepacia y después B. lata. Del mismo modo, otro paciente tuvo B. stabilis y después B. contaminans. En nuestro estudio, el 50% de los pacientes con CBC tenían cepas de Staphylococcus aureus (Tabla 1).

El análisis de la FPHGE muestra que se aisló la misma cepa en cada uno de los pacientes con FQ, pero fue diferente entre los pacientes, por lo que se certifica que no hubo transmisión cruzada.

El 90% de las CBC fueron sensibles al meropenem, el 80% al cotrimoxazol, el 60% a la minociclina, el 50% a la ceftazidima y el 40% a la levofloxacina, el 20% a la ciprofloxacina y el 10% al imipenem.

El 50% de los pacientes con FQ eran varones y la edad media en la que estos pacientes tuvieron su primer aislamiento de CBC fue de 24,4 años (DE: 7,71). El 41,7% de los pacientes tenía la mutación F508del/otra, el 33,3% tenía la mutación F508del/F508 y el 25% tenía otra/otra mutación.

Al principio se calculó la puntuación de Brasfield y Shwachman para todos los pacientes incluidos en este estudio, y la puntuación media fue de 18,6 y 82,3. Sin embargo, la puntuación actual de Brasfield y Shwachman se realiza con los pacientes colonizados. La puntuación media fue de 21,1 y 81. Sólo 1 paciente tenía diabetes y 6 pacientes tenían insuficiencia pancreática. La tabla 2 muestra las características clínicas de los pacientes con FQ que tenían CBC.

La Fig. 1 muestra la evolución de la función pulmonar (%FEV1) de los pacientes que tenían más de un aislamiento de CBC.

Fig. 1.

Evolución de la función pulmonar de los pacientes crónicos con FQ desde el primer aislamiento de CBC en esputo.

(0,1MB).

Discusión

Existen pocos estudios relacionados con la evolución clínica de los pacientes con una especie aislada de CBC, y existe la idea generalizada de que la especie B. cenocepacia se asocia a una mayor morbilidad y mortalidad en los pacientes con FQ.19 Por ello, no hay muchos datos recientes sobre pacientes con CBC en España. Un estudio realizado en el Hospital Universitario de Cruces muestra un aumento de la incidencia de colonización con BCC.29

Es importante que la identificación de las especies de BCC se realice en un centro especializado, ya que los facultativos ayudan a supervisar un estrecho seguimiento de estos pacientes que están colonizados por estas especies, ya que pueden evolucionar de forma adversa.

Un estudio realizado por Van Pelt et al.30 muestra que API 20 NE fue más preciso que MicroScan. El 90% de los aislados se identificaron correctamente con API 20NE frente al 68% con MicroScan. Sugieren el uso de placas BCSA para el aislamiento inicial de B. cepacia directamente de material clínico. La sensibilidad de estos medios de crecimiento parecía ser excelente (96%); la especificidad no era del 100%. Fue bastante llamativo encontrar que para los ensayos automatizados, como MicroScan, la precisión era insuficiente. El principal resultado del presente análisis es el hecho de que la identificación molecular mediante el análisis PCR-RFLP es superior a los procedimientos de identificación de especies bioquímicas y microbiológicas, aunque cabe destacar que los resultados obtenidos con API20 NE fueron satisfactorios.30

En nuestro estudio, se aislaron B. cenocepacia, B. contaminans, B. vietnamiensis, B. stabilis, B. multivorans, B. cepacia y B. lata de las secreciones respiratorias de 12 pacientes con FQ examinados y B. cenocepacia fue la especie más prevalente, como la mayoría de los datos descritos en la literatura europea de pacientes con FQ.19 Sin embargo, este descubrimiento no coincide con un estudio de Portugal (Susana Correia et cols), en el que las especies más frecuentes fueron B. cepacia 57% y B. stabilis 13%. Es posible que se deba a la utilización de soluciones salinas no estériles intrínsecamente contaminadas por B. cepacia.19 Estas soluciones contaminadas fueron detectadas por Infarmed durante una inspección microbiológica rutinaria.19 En nuestro estudio B. cepacia y B. stabilis se aislaron en menor proporción al igual que otros estudios en Europa y América.19

Entre los aislamientos de B. cenocepacia, hubo la misma proporción entre los subtipos IIIa y IIIb de B. cenocepacia.

Uno de los pacientes tuvo B. cenocepacia como primer aislamiento, B. lata como segundo aislamiento y luego fue erradicado. Otro paciente tuvo B. vietnamiensis en 2004 que fue erradicado, y se le hizo un trasplante de pulmón en 2011, y otro paciente fue aislado con B. cenocepacia subtipo IIIa en 2004, pero murió en el mismo año después de un trasplante de pulmón. Los resultados de supervivencia del trasplante de pulmón son peores en los pacientes que están colonizados por B. cenocepacia, por lo que algunas unidades de trasplante contraindican el trasplante en ese caso. Se ha reconocido que B. cenocepacia conlleva un peor pronóstico en comparación con B. multivorans, con una supervivencia más corta cuando se empareja con controles de Pseudomonas aeruginosa.31 Se ha informado del síndrome de Cepacia con estas dos especies.26 La fisiopatología exacta de este síndrome no se conoce, y la tasa de mortalidad precisa no se conoce, aunque se cree que se acerca al 100%.32

Nuestros pacientes tienen valores bajos de FEV1. Un gran número de pacientes ya se había deteriorado antes del aislamiento del CBC como resultado de la colonización por otros agentes patógenos y la progresión de la enfermedad. En los pacientes clínicamente estables no se observaron alteraciones significativas en los valores de FEV1 ni en el estado nutricional. Hay pruebas de que la colonización pulmonar podría no detectarse mediante cultivos estándar durante algún tiempo (hasta 2 años) después de la adquisición de la CBC.33 Además, no está claro si, en los casos de aislamiento intermitente, hay una reinfección por una nueva cepa o si hay un recrudecimiento de la cepa inicial.20 En la mayoría de los casos de nuestros diferentes aislamientos, no se observó un recrudecimiento de las cepas iniciales de CBC.

Se registraron casos en los que la misma cepa (con el mismo genotipo), que infectó de forma persistente a un paciente durante varios años, fue erradicada por la terapia antibiótica o no tuvo ningún impacto aparente en el cuadro clínico de otros pacientes. No está claro por qué las cepas de las distintas especies de CBC difieren en su persistencia, epidemiología y potencial patógeno en la FQ y por qué las mismas cepas pueden asociarse a evoluciones clínicas muy diferentes.19 Depende de factores inherentes a cada paciente individual, de la co-colonización por otros patógenos y de otros factores aún por identificar, lo que subraya la importancia de emprender estudios de este tipo.19

La resistencia a los antibióticos se considera un importante factor de virulencia de los organismos del CBC.14 Aunque la terapia suele guiarse por las pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos, rara vez se consigue la erradicación de los organismos del CBC.21 Se han formulado múltiples hipótesis para explicar este fracaso, entre las que se incluyen las concentraciones inadecuadas de antibióticos o la inactivación del antibiótico en el esputo, el deterioro de las defensas del huésped en los pacientes con FQ, la formación de biopelículas, el efecto «inóculo» y la tasa de crecimiento in vivo de estos organismos.34

Elke et al. informaron en un estudio belga de que el meropenem, la minociclina y la ceftazidima eran los antibióticos más activos contra el aislamiento de CBC y que la ciprofloxazina y el trimetoprim/sulfametoxazol tenían la actividad más baja.35 Sin embargo, nuestro estudio encontró que el meropenem era el más activo con un 90% de susceptibilidad, seguido del trimetoprim/sulfametoxazol, la minociclina y la ceftazidima con un 80%, 60% y 50%, respectivamente. Aunque los organismos de la CBC suelen ser resistentes a los aminoglucósidos, las dosis altas de tobramicina inhibieron la mayoría de las cepas probadas. La tobramicina nebulizada, que produce concentraciones máximas elevadas en el esputo, se utiliza cada vez más para tratar a los pacientes con FQ.36-38

En consecuencia, estas concentraciones más elevadas deben tenerse en cuenta al evaluar la utilidad de este antibiótico.35 Varios informes confirman que la tobramicina nebulizada es muy prometedora en el tratamiento de los pacientes con FQ infectados por CBC: por ejemplo, Weidmann et al.39 describieron recientemente la erradicación completa de los organismos de la CBC de los pulmones de los pacientes con FQ utilizando una combinación de tobramicina nebulizada y amilorida. Además, una terapia combinada con meropenem y tobramicina nebulizados e intravenosos también dio como resultado el tratamiento exitoso de una paciente con FQ que sufría el síndrome de cepacia, aunque las muestras de esputo de esta última paciente siguieron siendo positivas para B. cenocepacia.39

Las especies de BCC son intrínsecamente resistentes a muchos antibióticos como los aminoglucósidos y la polimixina B y a menudo requieren una terapia combinada para suprimir la infección en la FQ.11 Los antibióticos polimixina, gentamicina y vancomicina se utilizan en altas concentraciones en el Agar Selectivo de B. cepacia, un medio muy eficaz para su aislamiento del esputo de la FQ.11 Nzula et al.13 compararon la susceptibilidad a los antibióticos de seis especies de CBC y concluyeron que era muy variable, excepto en el caso de la resistencia innata a la polimixina, y que no estaba relacionada con el estado taxonómico de los aislados examinados. El eflujo, la secreción de betalactamasas cromosómicas y la impermeabilidad de la envoltura externa de las bacterias BCC se han implicado en la resistencia a los antibióticos.14

En cambio, la base molecular de la resistencia a los biocidas en las bacterias BCC se ha estudiado poco, a pesar de que estos organismos están relacionados con muchos casos de contaminación en desinfectantes y otras soluciones antiinfecciosas.40

La misión y, por tanto, el reto que plantea la identificación de las especies BCC para los laboratorios de microbiología clínica de rutina son diferentes. Las cepas aisladas en medios selectivos e identificadas tentativamente como pertenecientes a la CBC mediante sistemas comerciales deben confirmarse con las pruebas bioquímicas clásicas descritas.41

La detección precoz de la CBC es extremadamente importante tanto para el paciente con FQ como para la comunidad de FQ. Sin embargo, un estudio reciente5 indicó que menos de la mitad de los centros de EE.UU. encuestados emplean medios selectivos específicos para B. cepacia o incuban los cultivos durante períodos prolongados, lo que mejora el rendimiento de este organismo. El uso de estas técnicas de cultivo actualizadas no es exigente desde el punto de vista técnico y debería ser el estándar de atención esperado en todos los centros de FQ del mundo.

En este estudio, sólo erradicamos B. cenocepacia en un paciente; otro paciente falleció inmediatamente después del trasplante, y ninguno de los dos tuvo síndrome de cepacia y sufrió un deterioro clínico importante, aunque el período de observación fue corto porque adquirieron BCC recientemente.

La mejora del diagnóstico de las infecciones causadas por miembros de la BCC y otros organismos similares a la B. cepacia ayudará a la interpretación de los resultados de los estudios de resultados clínicos y, al hacerlo, proporcionará información crucial sobre la patogenicidad y/o transmisibilidad de las cepas específicas implicadas.5

Conflicto de intereses

Ninguno de los autores tiene ningún conflicto de intereses que declarar.