Guanidina

Proteínas de membrana

Las soluciones de guanidina y SDS son disolventes desnaturalizantes pero queríamos, por supuesto, caracterizar también los estados nativos de las proteínas de membrana. La dificultad aquí era que todavía no había un consenso sobre cómo definir o concebir el estado nativo -lo que, para los recién llegados como nosotros, se traducía en incertidumbre, porque no teníamos el tipo de experiencia que nos permitiera hacer una conjetura astuta sobre cuál de las ideas contendientes era probable que resultara correcta.

Incluso la bicapa de fosfolípidos, el único concepto indispensable para la más mínima comprensión de las membranas celulares, seguía siendo discutida, a pesar de que había sido demostrada por primera vez en los glóbulos rojos casi 50 años antes y de que era realmente la única disposición concebible sobre la base de la termodinámica, una consecuencia directa de las mediciones clásicas de Irving Langmuir en 1917 con monocapas de sustancias anfifílicas. He descrito la ridícula lentitud con la que se aceptó el concepto de bicapa en el período intermedio en mi libro Ben Franklin Stilled the Waves . El punto aquí es que el escepticismo aún persistía cuando nos involucramos en la investigación de las membranas.

Y entre aquellos que estaban convencidos de la bicapa lipídica, la forma de incorporación de las proteínas en las membranas aún estaba abierta al debate. Algunos, como nuestro colega de Duke David Robertson, se resistían a creer que las proteínas pudieran realmente penetrar o atravesar una bicapa. En la figura 3 se muestran dos imágenes conceptuales bastante dispares, tomadas de una conferencia en la Academia de Ciencias de Nueva York en 1972. Una es la «membrana unitaria» de Robertson con la proteína totalmente en el exterior. La otra es la visión de Vanderkooi de los complejos de citocromo oxidasa en las membranas mitocondriales: la proteína está colocada de forma más realista, pero todavía no hay ninguna concepción de los dominios hidrofílicos e hidrofóbicos distintos y de cómo podrían dictar la interacción proteína-lípido. Más tarde, en ese mismo año de 1972, la imagen idealizada, ahora convencional, de las bicapas de fosfolípidos, con las proteínas en funcionamiento recorriéndolas, se popularizó finalmente con el modelo de «mosaico fluido» de Singer y Nicolson.

Fig. 3. Dos imágenes conceptuales dispares de las proteínas de membrana, ambas propuestas en la misma reunión de Nueva York en 1972 : (a) Robertson pensaba que las proteínas estarían dispuestas asimétricamente, fuera de las dos superficies de la bicapa; (b) la visión de Vanderkooi de los complejos de citocromo oxidasa en sección transversal.

En el laboratorio fueron tiempos emocionantes, los más emocionantes que recuerdo. Aprendimos a utilizar detergentes benignos que, a diferencia del SDS, podían solubilizar las proteínas de membrana sin desnaturalizarlas groseramente, en un entorno que simulaba el estado nativo, pero un entorno en el que también serían fácilmente accesibles para su caracterización molecular, un avance en el que nos anticiparon en parte dos simpáticos jóvenes de Finlandia, Kai Simons y Ari Helenius .

En la práctica, todavía nos limitábamos principalmente a medir el peso molecular y a preguntar cuántas cadenas polipeptídicas por molécula, pero las proteínas a las que se dirigían estas preguntas habían sido separadas por tratamiento con detergente de otros componentes de la membrana. Lo más importante es que muchas de las proteínas tenían una función celular conocida y nuestras mediciones eran relevantes para estas funciones. Ya he mencionado los glóbulos rojos, pero en realidad conseguimos abarcar una serie de temas biológicamente relevantes, espoleados en muchos casos por el celo misionero de los estudiantes. Por ejemplo, un estudiante de posgrado de fisiología, Stuart Grefrath, interesado en la neurofisiología, vino a nuestro laboratorio para enumerar las cadenas polipeptídicas de una membrana excitable -en este caso del nervio olfativo del pez- y esto nos llevó a involucrarnos posteriormente con varios otros sistemas de transporte activo . (El propio Stuart murió, lamentablemente, a consecuencia de una enfermedad cardiovascular congénita antes de poder cumplir su temprana promesa con una carrera independiente). La mielina cerebral fue otra membrana del sistema nervioso que estudiamos.

También merece la pena destacar a dos visitantes del laboratorio que decidieron trabajar juntos: Neal Robinson, un becario postdoctoral, y Leon Visser, que estaba de permiso sabático del CSIR en Pretoria, Sudáfrica). Hicieron un trabajo muy limpio al definir cuantitativamente la estructura de dominio del citocromo b5, una especie de prototipo para ilustrar cómo las proteínas de membrana se adhieren a las membranas y siguen desempeñando su función en el citoplasma adyacente.

En otros proyectos estábamos respondiendo a peticiones de colegas lejanos. Ya he mencionado el trabajo con Arthur Karlin sobre el receptor de acetilcolina de un pez eléctrico. Otro ejemplo fue la bacteriorrodopsina, para la que hicimos mediciones en solución detergente a instancias de Walter Stoeckenius de la Universidad de California . Aquí se planteaba una cuestión importante, relacionada con el mecanismo de la actividad de bombeo de protones de esta proteína: ¿es la proteína nativa funcionalmente un monómero o (como parecían sugerir algunos datos) es un trímero? Nuestra proteína solubilizada era incuestionablemente un monómero y las pruebas espectrales indicaban que pasaba por el mismo ciclo de cambios moleculares que en la membrana nativa.

En la mayoría de los casos, nosotros mismos no nos involucramos directamente en tratar de descifrar cómo funcionaban los receptores o las bombas o los canales, pero inevitablemente nos dimos cuenta de cuáles eran los problemas. Fue una experiencia realmente enriquecedora, muy diferente de los días en que la albúmina sérica y la β-lactoglobulina (obtenidas de proveedores comerciales) eran los objetivos principales de nuestra investigación.

En el caso de las bombas de iones sí que nos adentramos en la fisiología, sobre todo a nivel de hipótesis o teoría; aprendimos a modelar esquemas cinéticos con un ordenador; asistimos a conferencias apropiadas; etc. Nuestra última licencia sabática -en el Instituto Max Planck de Heidelberg- fue importante en este sentido. El director del departamento de fisiología de Duke, Ted Johnson, se unió a nosotros en esta ocasión, por lo que éramos tres los que colaborábamos activamente . Ted era un entusiasta de los ordenadores desde hacía mucho tiempo, y había conectado a todos los miembros de la facultad de Fisiología a la instalación central de ordenadores del Triángulo de Investigación de Carolina del Norte antes de que se pusiera de moda gastar fondos departamentales de esa manera. En aquella época teníamos que escribir nuestros propios programas para el ordenador, lo que me resultaba difícil, pero creo que obtuvimos algunos resultados útiles, sobre todo en modelos cinéticos para el ciclo de bombeo de la bomba de Na,K impulsada por ATP. Trabajábamos en horarios poco ortodoxos, incluidos los fines de semana y los días festivos, lo que a veces incomodaba a nuestros anfitriones de Heidelberg, acostumbrados a apagar la calefacción central cuando se suponía que el laboratorio estaba desocupado. Aproximadamente cada diez días cruzábamos la frontera con Estrasburgo para disfrutar de un almuerzo gourmet, acompañado de vinos alsacianos, cuyo sabor disfrutamos desde entonces.