Gamma-Glutamil Transpeptidasa

Actividad y Especificidad

Por lo tanto, la reacción catalizada por esta enzima se entiende generalmente como la transferencia de un grupo γ-glutamilo a una variedad de moléculas aceptoras como agua, aminoácidos, dipéptidos y el propio donante de γ-glutamilo, dependiendo de las condiciones de reacción. Estas propiedades catalíticas están asociadas con el mecanismo catalítico de la GGT, en el que la reacción procede por un mecanismo de doble desplazamiento de acilación-deacilación a través de un intermedio γ-glutamil-enzimático.

Como se esperaba de las estructuras del sustrato natural glutatión y sus derivados, la GGT reconoce estrictamente la fracción γ-glutamil, pero tiene una especificidad de sustrato bastante amplia con respecto al grupo saliente (Xaa). Se aceptan como sustratos el glutatión, sus conjugados S, el disulfuro de glutatión, los dipéptidos o tripéptidos γ-glutamílicos, la glutamina, los derivados l-α-metilos de las γ-glutamilas, el leucotrieno C4 y los derivados poli-γ-glutamílicos. Los sustratos artificiales como la l-γ-glutamil-p-nitroanilida (l-γ-Glu-pNA) y la l-γ-glutamil-7-amino-4-metilcumarina fluorescente (l-γ-Glu-AMC) son sustratos activos utilizados habitualmente en presencia o en ausencia de aceptores de γ-glutamil (véase más adelante) para el ensayo de transpeptidasas o hidrolasas, respectivamente.

La especificidad del sustrato con respecto al aceptor se ha estudiado más ampliamente con la GGT de riñón de rata . Los l-isómeros de aminoácidos neutros como l-cistina, l-Gln, l-Met, l-Ala, l-Cys y l-Ser son buenos aceptores, pero los aminoácidos hidrofóbicos y de cadena ramificada como l-Phe, l-Trp, l-Leu, l-Ile y l-Val son sustratos bastante pobres. Los d-aminoácidos y los aminoácidos α-sustituidos no actúan como sustratos aceptores. Por lo tanto, el uso de d-γ-Glu-pNA es una forma conveniente de suprimir la autotranspeptidación en la medición de la actividad hidrolasa . Dado que el sitio de unión al aceptor se solapa con los subsitios para la fracción Cys-Gly del glutatión, la enzima prefiere los dipéptidos con Gly en el C-terminal como l-Met-Gly, l-Gln-Gly, l-Ala-Gly, l-cystinyl-bis-Gly, Gly-Gly y l-Ser-Gly como sustratos aceptores en orden descendente de actividad relativa . Los péptidos con más de dos residuos de aminoácidos son aceptores muy pobres. Los valores de Km para los aminoácidos aceptores y los dipéptidos son relativamente elevados, situándose en el rango de 0,1 a 5 mM , pero el Gly-Gly (Km=3 mM) es el más conveniente como sustrato aceptor para la actividad de la transpeptidasa. Altas concentraciones de moléculas aceptoras inhiben la GGT de forma competitiva con respecto al donante γ-glutamilo (γ-Glu-Xaa), probablemente debido al solapamiento del sitio de unión para Xaa y el del aceptor. La especificidad del sustrato con respecto al subsitio Cys depende del origen de la enzima; la enzima E. coli, por ejemplo, prefiere aminoácidos básicos (l-Arg, l-Lys y l-His) y aminoácidos aromáticos (l-Phe, l-Trp y l-DOPA) en este sitio . Sin embargo, hay que tener cuidado con la especificidad del aceptor, porque la actividad aparente también depende de la concentración efectiva del aminoácido desprotonado disponible en el pH en cuestión. La actividad relativamente alta observada con Gly-Gly se debe en parte al bajo pKa de este dipéptido . Los grupos aminos desprotonados de los sustratos aceptores parecen ser necesarios para la transpeptidación.

El sustrato donante más utilizado para el ensayo de la enzima es el l-γ-Glu-pNA. Una mezcla de ensayo típica para la actividad transpeptidasa de la enzima de riñón de rata consiste en 5 mM de l-γ-Glu-pNA, 100 mM de Gly-Gly en Tris-HCl 0,1 M (pH 8,0) a 25°C. La adición de una concentración suficiente de Gly-Gly suprime eficazmente la hidrólisis y la autotranspeptidación. El pH óptimo de la GGT es de aproximadamente 7,5-9 para la transpeptidación, pero la dependencia del pH es mucho menor para la hidrólisis . Esto es consistente con el hecho de que la actividad aparente de la transpeptidasa depende, en parte, de la concentración efectiva del grupo amino libre de los aceptores.

La actividad de la hidrolasa para la glutamina se incrementa hasta 12 veces añadiendo moduladores dirigidos al sitio del aceptor como el maleato, el hipurato y el glucocolato. La adición de estos compuestos inhibe la unión de los sustratos aceptores y los donantes de γ-glutamilo que ocupan los subsitios Cys-Gly. La adición de donantes de γ-glutamilo o la unión de inhibidores en el sitio del donante de γ-glutamilo aumenta la afinidad de estos moduladores, lo que indica interacciones cooperativas entre los sitios de unión de los donantes de γ-glutamilo y los aceptores (para una revisión véase Tate & Meister ). Se sugiere que el sitio aceptor ocupado por estos moduladores promueve un cambio conformacional de la GGT hacia una forma activa, facilitando así la formación de un estado de transición. Esto también se propone para explicar el aumento de la tasa de inactivación de las enzimas de mamíferos por acivicina (vide infra), pero esto no se observó con la inhibición por un γ-monofluorofosfonato, una etiqueta de afinidad análoga al estado de transición dirigida al sitio activo . La acivicina parece unirse a un residuo nucleófilo distinto del nucleófilo catalítico de la GGT de mamíferos.

La GGT es inhibida de forma reversible y competitiva por la l- y d-γ-glutamil-(o-carboxi)fenilhidrazida (anglutina, producida por Penicillium oxalicum) con un Ki de 8 μM, y no se informa de toxicidad aguda para los ratones . Varios análogos del glutamato con un grupo reactivo cerca del γ-carboxi actúan como inhibidores irreversibles. La 6-Diazo-5-oxo-l-norleucina (DON), la O-diazoacetil-l-serina (l-azaserina) y el ácido l-(αS,5S)-α-amino-3-cloro-4,5-dihidro-5-isoxazoleacético (acivicina o AT-125, producido por Streptomyces sviceus) son inactivadores potentes pero no específicos de la GGT . La acivicina se ha utilizado ampliamente para suprimir la actividad de la GGT in vivo , aunque la acivicina es altamente tóxica al inactivar una serie de glutamina amidotransferasas implicadas en la biosíntesis de nucleótidos, aminoácidos y aminoazúcares . El complejo serina-borato se une de forma reversible al sitio de unión del γ-glutamilo para inhibir la GGT con un Ki de 20 μM . Este hallazgo clásico ha dado lugar a un inhibidor potente y de unión lenta, el ácido l-2-amino-3-boronobutanoico (γ-boroGlu) . La GGT se inhibe con un Ki global de 17 o 35 nM, pero la inhibición sigue siendo reversible. El ácido 2-amino-4-(fluorofosfono)butanoico (γ-PFGlu), un análogo del glutamato con un fósforo electrófilo que sustituye al γ-carboxi, es un potente agente de etiquetado de afinidad basado en el mecanismo y dirigido al sitio activo de la GGT de E. coli . Este compuesto inhibe rápida e irreversiblemente la GGT para formar un aducto estable, aniónico y tetraédrico similar al estado de transición, que es susceptible de ser mapeado con péptidos para identificar el nucleófilo catalítico de la GGT de E. coli (vide infra). Una serie de análogos de glutamato γ-(monofenil)fosfono- y γ-fosfonodiéster sirven como inhibidores basados en el mecanismo que inhiben la GGT de forma irreversible mediante la modificación covalente de su nucleófilo catalítico. En particular, los γ-fosfonodiésteres que incorporan el imitador estructural de Cys-Gly y su grupo carboxilo C-terminal exhiben actividades extraordinariamente altas hacia la GGT humana, siendo la tasa de inactivación de 130 a 6000 veces más rápida que la de la acivicina. La inhibición es selectiva para la GGT y no se observa ninguna toxicidad. Uno de estos inhibidores está disponible comercialmente con el nombre de «GGsTop» (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).

Se ha encontrado un inhibidor de la GGT humana no análogo al glutamato mediante un cribado de alto rendimiento. Este compuesto ocupa el sitio aceptor del complejo sustrato γ-glutamilo con un Ki de 17,6 μM. El inhibidor es selectivo con la especie, pero es reversible, y se ha informado de cierta toxicidad.

Se cree que la reacción catalizada por la GGT procede con un mecanismo de ping-pong a través de un intermedio γ-glutamil-enzima como se ha observado con las serina hidrolasas . La Thr Oγ N-terminal de la subunidad pequeña es el nucleófilo catalítico al que se une un grupo γ-glutamilo (ver Química Estructural). El nucleófilo catalítico de la GGT se identificó por primera vez con la GGT de E. coli como el residuo Thr N-terminal (Thr391) en la subunidad pequeña mediante el mapeo peptídico de la enzima inactivada con γ-PFGlu . Este residuo, que corresponde a la Thr380 (enzima de riñón de rata) y a la Thr381 (enzima humana), se conserva entre todas las GGTs cuyas secuencias primarias se conocen. El nucleófilo catalítico de la GGT humana se identifica como Thr381 mediante el mapeo peptídico de la enzima inactivada por la etiqueta de afinidad γ-(monofenil)fosfona . Por lo tanto, la reacción catalizada por la GGT comienza con el ataque nucleofílico del residuo Thr N-terminal en la subunidad pequeña sobre el γ-carboxi de un sustrato donante (γ-Glu-Xaa) para eliminar el Xaa. La enzima γ-glutamilo así formada reacciona con agua (hidrólisis) o con aminoácidos y dipéptidos (transpeptidación y autotranspeptidación) en el paso determinante de la tasa .

La GGT es un miembro de las hidrolasas nucleófilas N-terminales (Ntn-hidrolasas) como se predijo a partir de su pliegue único y del proceso de maduración, en el que se genera una forma dimérica activa de la enzima madura mediante el procesamiento autocatalítico postraduccional del precursor catalíticamente inactivo. Esto se confirma mediante mutagénesis dirigida al sitio y el análisis estructural por rayos X de las enzimas bacterianas (véase Química Estructural).