EzColocalization: An ImageJ plugin for visualizing and measuring colocalization in cells and organisms

Overview of EzColocalization workflow

El flujo de trabajo de EzColocalization se divide en cuatro módulos, cada uno con su propia pestaña en la interfaz gráfica de usuario. Las pestañas son: (i) «Inputs» donde se seleccionan y alinean las imágenes, las máscaras o las listas de regiones de interés (ROI); (ii) «Cell Filters» donde se pueden seleccionar las células en función de las características físicas y la intensidad de la señal; (iii) «Visualization» donde se crean los mapas de calor, los gráficos de dispersión y las matrices métricas (definidas a continuación); y (iv) «Analysis» donde se eligen las métricas de colocalización y los resultados. No es necesario utilizar todos los módulos ni todos los procesos de un módulo. Algunas pestañas tienen un botón «Preview» para ejecutar un módulo específico en lugar del botón «Analyze» que ejecuta todos los procesos seleccionados en todos los módulos.

Inputs

Los archivos de imagen, que se eligen en la pestaña «Inputs» (Fig. 1A), deben ser: (i) monocromáticos (es decir, no en formato RGB o CMYK); (ii) de 8, 16 o 32 bits; y (iii) en un formato como TIFF que conserve los valores originales de intensidad de los píxeles. Las imágenes de gran tamaño pueden comprimirse para la transferencia de archivos utilizando un formato sin pérdidas como ZIP o LZW, y luego descomprimirse para su análisis. Además de las imágenes, EzColocalization puede aceptar máscaras y listas de ROI para la identificación de células (ver más abajo). Si hay múltiples imágenes para cada canal, las imágenes deben apilarse para un análisis más eficiente en el menú «Stack» (véase la guía de ImageJ para más detalles24). Las imágenes de una pila pueden ser diferentes campos de visión o una serie temporal, pero deben tener las mismas dimensiones, aumento y orden de imagen para cada canal. La pestaña de entrada también ofrece opciones para establecer umbrales de intensidad de la señal y alinear imágenes desalineadas de diferentes canales (Fig. 1B e Información complementaria). En la Información complementaria se ofrecen recomendaciones para adquirir imágenes adecuadas para el análisis de colocalización. Nota: la alineación funciona bajo el supuesto de que se puede elegir un umbral apropiado para la intensidad de la señal para distinguir los píxeles dentro y fuera de las células; si el umbral incluye áreas fuera de la célula o sólo un área limitada dentro de las células, entonces la alineación puede no funcionar correctamente. Por esta razón, todas las alineaciones deben comprobarse visualmente examinando los ROIs para confirmar que se seleccionan las áreas celulares apropiadas.

EzColocalization está diseñado principalmente para un canal de «identificación celular» y dos o tres imágenes de canal «reportero». Sin embargo, puede funcionar con otras combinaciones de entrada (Tabla S1). El canal de identificación celular se utiliza para identificar células individuales y, en consecuencia, para distinguir los píxeles intracelulares y extracelulares. El canal de identificación celular puede ser cualquier tipo de imagen que permita identificar los límites de la célula, incluyendo: imágenes de microscopía de luz (por ejemplo, contraste de fase25,26 y campo brillante), imágenes con un reportero que etiquete la membrana celular o que esté en todo el citoplasma (por ejemplo, Cy5, Fig. 1B), e imágenes con un colorante extracelular que delinee las células. Las imágenes con contraste de interferencia diferencial (DIC) crean sombras que dificultan la selección automatizada de las células mediante métodos de umbral27; por lo tanto, para las imágenes DIC recomendamos crear ROIs utilizando las «herramientas de selección» de ImageJ para delinear manualmente las áreas de las células, y luego añadirlas a una lista eligiendo «Add to Manager» (en el submenú «Selection» del menú «Edit»). Una vez seleccionados los ROI de todas las células de interés en una imagen, se puede crear una máscara binaria utilizando las funciones «Clear Outside» y «Autothreshold» de ImageJ.

Filtros de células

La pestaña «Cell Filters» se utiliza para ayudar a seleccionar las células en las imágenes (Fig. 2A) y distinguir los píxeles intracelulares y extracelulares. Las células se identifican mediante: (i) eligiendo uno de los algoritmos de umbral de ImageJ24, o seleccionando manualmente los umbrales (lo que se hace seleccionando «*Manual*» de una lista desplegable en la pestaña Inputs y pulsando el botón «Show threshold(s)»), para identificar las regiones correspondientes a las células en el canal de identificación celular (Fig. 2B); (ii) utilizar la segmentación de cuenca para separar los objetos que se tocan en las imágenes del canal de identificación celular (opcional) (Fig. 2B); (iii) seleccionar objetos de las imágenes del canal de identificación celular basándose en parámetros físicos (Fig. 2C) y en la intensidad de la señal (Fig. 2D). EzColocalization intentará detectar automáticamente si las imágenes de entrada tienen un fondo oscuro o claro utilizando la asimetría. Asumiendo que hay más píxeles en el fondo que en las células, una imagen con skewness positivo indica un fondo oscuro y skewness negativo indica un fondo claro. Los usuarios también pueden seleccionar manualmente si las imágenes de entrada tienen fondo oscuro o claro en las opciones «Parámetros…» del menú «Configuración». Las celdas que sólo están parcialmente dentro de una imagen, y por lo tanto podrían proporcionar valores engañosos, se eliminan automáticamente de los análisis.

EzColocalization tiene un «filtro de pre-cuenca» opcional y ocho filtros de post-cuenca opcionales (con la opción de seleccionar más). La segmentación Watershed puede ayudar a separar las células que se dividen y se tocan28 , pero también puede dividir objetos grandes, como agregados de material extracelular, en fragmentos más pequeños del mismo tamaño que las células. Para evitar esto último, se puede utilizar el filtro Pre-watershed para excluir del análisis los objetos con áreas grandes. El botón Vista previa de la pestaña Filtros de células permite a los usuarios ver qué objetos de la imagen actual se seleccionarán cuando se ajusten los límites mínimo y máximo de todos los filtros. Hay dos clases de parámetros para los filtros de celdas posteriores a la cuenca (Tabla S2) (i) parámetros físicos basados en las mediciones del canal de identificación de células; y (ii) parámetros de intensidad de señal de los canales reporteros. Los parámetros físicos se aplican a todos los canales, mientras que los parámetros de intensidad de señal se aplican sólo al canal informador para el que se seleccionan (porque los informadores pueden tener niveles de señal muy diferentes). Además del filtrado basado en opciones predefinidas en ImageJ, EzColocalization tiene filtros para el «MeanBgndRatio» o «MedianBgndRatio», que se calculan dividiendo la media o la mediana de la intensidad de la señal de los píxeles dentro de un objeto por la respectiva media o mediana de la intensidad de la señal de los píxeles extracelulares.

Visualización

La pestaña «Visualización» muestra las señales o métricas en las células como: (i) «mapas de calor»; (ii) gráficos de dispersión; y (iii) «matrices métricas» (Fig. 3A).

Los mapas de calor son imágenes de pseudocolor que muestran la magnitud relativa de las señales del reportero (Fig. 3B). Se generan mediante la normalización y el cambio de escala para que los valores mínimo y máximo de los píxeles sean 0 y 255 respectivamente en cada celda, imagen o pila. Hay ocho opciones para colorear los mapas de calor, y los valores de intensidad para cada color se obtienen de la función «Show LUT» (dentro del submenú «Color» del menú «Image» en ImageJ). Los mapas de calor de las células son adecuados para determinar dónde aparece cada informador con mayor intensidad en las células. Los mapas de calor de imágenes pueden mostrar si diferentes células dentro de un campo de visión tienen intensidades sustancialmente diferentes, lo que puede indicar heterogeneidad biológica o desigualdad en el etiquetado. Los mapas de calor de la pila pueden mostrar si las células en diferentes imágenes tienen niveles sustancialmente diferentes de intensidad de la señal, lo que puede indicar desigualdades en el etiquetado o en las mediciones a través de un portaobjetos (por ejemplo, debido al fotoblanqueo) o cambios en la señal a lo largo del tiempo (si la pila es una serie temporal). Nota: la apariencia del mapa de calor se ve afectada por los ajustes de brillo y contraste.

Los gráficos de dispersión muestran la relación entre la intensidad de la señal para dos o tres canales de reportero para células individuales e imágenes (Fig. 3C). Esta relación es importante para elegir la métrica de colocalización adecuada (Información suplementaria). Los gráficos de dispersión también pueden revelar la heterogeneidad en los patrones de localización8, que pueden requerir la eliminación de los píxeles de fondo o análisis separados para diferentes tipos de células.

Las matrices métricas proporcionan una visión general de los patrones de localización mostrando los valores calculados de una métrica de colocalización para muchas combinaciones de umbral. Las matrices métricas para la puntuación de solapamiento del umbral (TOS) han demostrado ser útiles para el análisis de los patrones de localización para dos canales informadores8,15 (Fig. 3D). Para completar, EzColocalization tiene la opción de calcular matrices métricas para dos canales informadores utilizando otras cinco métricas: puntuación de solapamiento de umbral con escala logarítmica8, coeficiente de correlación de Pearson (PCC), coeficientes de colocalización de Manders (M1 y M2), coeficiente de correlación de rango de Spearman (SRCC) y cociente de correlación de intensidad (ICQ)8,15. La colocalización para tres canales también puede medirse utilizando el ICQ, los coeficientes de colocalización de Manders y el TOS29 (Información complementaria).

Los umbrales para todas las métricas se miden como el percentil superior (FT) de los píxeles para la intensidad de la señal8,15. Por ejemplo, FT = 0,1 es el 10% de los píxeles con la señal más alta. En el caso de las matrices métricas, el FT también se utiliza para especificar el tamaño del paso para las combinaciones de umbrales. Es decir, FT = 0,1 también selecciona los umbrales para el 10%, 20%, …, y 100% de los píxeles con la señal más alta. Si FT no se divide uniformemente en 100, entonces el porcentaje restante es el último tamaño de paso. Para las métricas que no necesitan un umbral (es decir, PCC, SRCC e ICQ) los valores se calculan asumiendo que sólo existen los píxeles por encima de los umbrales. La ventana de la matriz de métricas tiene opciones para guardar los resultados como texto o imagen, para cambiar el FT o el tipo de métrica, para ver los valores de las métricas de las celdas individuales como una lista y para calcular la media, la mediana o la moda de la métrica para cada combinación de umbrales. El botón «Proc» (procesado) y «Raw» (sin procesar) determina si la lista de datos mostrada, copiada o guardada con los botones «List», «Copy» o «Save…» respectivamente es el valor medio de la muestra para cada combinación de umbrales (por ejemplo, el valor de la mediana) o todos los valores de cada celda de la muestra para todas las combinaciones de umbrales.

Análisis

La pestaña «Análisis» tiene tres subpestañas («Métricas de análisis», «Información de métricas» y «Personalizada»). La subpestaña «Analysis Metrics» tiene seis métricas para medir la colocalización de dos reporteros (Fig. 4A) y tres métricas para tres reporteros (véase la sección anterior). Los usuarios pueden elegir un umbral o ningún umbral para PCC, SRCC e ICQ. Los coeficientes de colocalización de TOS y Manders deben tener un umbral para ser calculados. La subpestaña Metrics Info contiene información y recursos sobre las métricas utilizadas en la subpestaña Analysis Metrics (más detalles en la Información complementaria). Los umbrales pueden seleccionarse mediante el método de Costes30 o manualmente. En la subpestaña Custom (véase la Información complementaria para más información), los usuarios pueden escribir su propio código en JavaTM para analizar las imágenes (nota: el ejemplo proporcionado es para calcular el PCC) (Fig. 4B). El botón «Compile» prueba el código y crea un archivo temporal en el directorio temporal de Java y muestra el resultado de la compilación con una etiqueta de «Succeeded» o «Failed». Si tiene éxito, el código personalizado compilado se lee de nuevo en la memoria y se aplica a las celdas seleccionadas.

El resultado de cada análisis es una tabla que especifica la imagen y un número identificador para cada celda (Fig. 4C), y para cada celda se proporcionan valores para: (i) la métrica seleccionada; (ii) los parámetros físicos; y (iii) la intensidad media de la señal para cada canal (si se ha seleccionado). Nota: «NaN» en la tabla de salida indica la imposibilidad de calcular un valor. Los usuarios también pueden generar ventanas de resumen (con el número de células, la media, la mediana y la desviación estándar para la métrica seleccionada) (Fig. 4D), histogramas de los valores de la métrica (Fig. 4E), imágenes de máscara binaria y una lista de ROIs que representan la posición y el número de cada célula en cada imagen del gestor de ROIs. Las listas de ROI y las imágenes de máscara binaria pueden guardarse para volver a analizar las mismas células.

Aplicaciones de EzColocalization

EzColocalization está diseñado para ser utilizado de forma modular para facilitar la personalización de los análisis para una amplia variedad de experimentos y necesidades de los investigadores. Esta sección se centra en la demostración de herramientas específicas de EzColocalization para resolver problemas del mundo real en diversos conjuntos de imágenes.

En la primera aplicación de EzColocalization, se utilizan imágenes de neuronas de hipocampo de rata de la Cell Image Library (CIL:8773, 8775-8788, que se atribuyen a Dieter Brandner y Ginger Withers) para demostrar: (i) el uso de un canal reportero para la identificación de células cuando un experimento no tiene imágenes separadas no reporteras para la identificación de células; (ii) los filtros de células para la selección de células; y (iii) las herramientas de visualización para la elección de métricas. El flujo de trabajo del análisis se describe en la Fig. 5A. En el primer paso, se crearon dos pilas de imágenes reporteras: una pila con imágenes en las que se marca la F-actina (utilizando un péptido de faloidina conjugado con rodamina); y la segunda pila con imágenes en las que se marca la tubulina (utilizando un anticuerpo conjugado con Alexa 488) (Fig. 5B). La interacción de la F-actina y la tubulina es importante para el crecimiento y la migración de las neuronas31,32. Utilizamos las imágenes de F-actina para la identificación de las células porque está presente en todas ellas y muestra los límites celulares8. Se seleccionaron células individuales de las imágenes de F-actina aplicando un umbral para identificar las células24 y utilizando un filtro celular para eliminar los restos celulares (nota: valores de los parámetros en la Fig. 5A).

Una vez seleccionadas las células, se examinó la intensidad de las señales del reportero utilizando mapas de calor celular y gráficos de dispersión. Encontramos que los reporteros no se colocalizaban a niveles de señal altos y había una relación compleja entre las intensidades de las señales (Fig. 5C,D). Debido a esto último, la localización se cuantificó utilizando M1 y M2 de Manders y TOS (Información Suplementaria). M1 y M2 se evaluaron en los umbrales seleccionados por el método de Costes para la célula esbozada en la Fig. 5B, y los valores fueron 0,289 y 0,995 respectivamente. Estos valores suelen interpretarse como indicación de que la tubulina tiene una alta colocalización con la F-actina, y la F-actina tiene una baja colocalización con la tubulina. Los valores de TOS se evaluaron generando una matriz métrica con los valores medianos de TOS. La matriz mostró colocalización, anticolocalización y no-colocalización en diferentes umbrales para las intensidades de señal de tubulina y F-actina (Fig. 5E). En los sitios de las células donde la F-actina y la tubulina tienen la señal de mayor intensidad (el 10% superior de los píxeles para cada canal), la mediana del valor TOS es de -0,36 (n = 20). Este valor negativo indica anticolocalización, lo que concuerda con la impresión obtenida de los mapas de calor y los gráficos de dispersión, y con otros informes8.

En la segunda aplicación, se obtuvieron imágenes de Saccharomyces cerevisiae en mitosis de la Cell Image Library33 para demostrar: (i) la identificación de células a través de contornos dibujados a mano (para experimentos en los que no se pueden aplicar métodos automatizados de identificación de células); y (ii) la alineación de imágenes. Las entradas del reportero fueron una imagen de una cepa de tipo salvaje («control»; CIL: 13871) que tiene la proteína BFA1 que carga TEM1 en el cuerpo del polo del huso, y una imagen de una cepa sin la proteína BFA1 (mutante de deleción ∆bfa1; CIL: 13870). En estas imágenes reporteras, las células expresaban la proteína TEM1 fusionada a GFP y el ADN estaba marcado con DAPI (4′, 6-diamidino-2-fenilindol). TEM1 se localiza en los cuerpos de los polos del huso durante la mitosis y está implicada en la activación de la salida de la mitosis33. El flujo de trabajo se muestra en la Fig. 6A. En esta aplicación, se dibujaron manualmente ROIs alrededor de las células utilizando la herramienta de selección «Freehand» en ImageJ sobre imágenes DIC. Las máscaras binarias, que se utilizaron para seleccionar las áreas celulares, se crearon seleccionando los ROIs y utilizando las funciones «Clear Outside» y luego «Auto Threshold» de ImageJ24 (Fig. 6B). Las áreas celulares se utilizaron para la identificación de células y para corregir la alineación entre las imágenes DIC y los canales reporteros utilizando el algoritmo de umbral «Default» (Fig. 6C). Después de esta identificación celular y alineación de imágenes, las imágenes están ahora listas para la visualización y el análisis como se describe en el ejemplo anterior.

En la tercera aplicación, se utilizaron imágenes de Caenorhabditis elegans adultas enteras obtenidas de la Broad Bioimage Benchmark Collection (BBBC012v1, M14)34 para demostrar que: (i) EzColocalization puede analizar la colocalización en organismos enteros; y (ii) los filtros de «célula» pueden seleccionar organismos individuales basados en la intensidad de la señal del reportero. Las imágenes de este ejemplo proceden del mismo conjunto de datos utilizado en nuestro estudio que describe el TOS (pero no son las mismas imágenes)8. El flujo de trabajo se muestra en la Fig. 7A. Los contornos de los individuos de C. elegans se dibujaron en ImageJ sobre las imágenes de campo brillante para crear ROIs, y los ROIs se añadieron al gestor de ROIs para la identificación de «células». La GFP expresada a partir del promotor clec-60 en el intestino anterior fue el reportero 1 y el mCherry expresado a partir del promotor myo-2 dentro de la faringe, que es un órgano próximo al intestino anterior35 , fue el reportero 2. Los filtros de células para los parámetros físicos eran innecesarios porque sólo los objetos considerados como C. elegans adecuados tenían contornos dibujados a su alrededor en primer lugar. Sin embargo, los filtros de células para la intensidad de la señal fueron necesarios porque algunos C. elegans tenían una baja señal de GFP, posiblemente debido al silenciamiento del transgén36,37 (Fig. 7B). Visualización y análisis posterior se puede realizar como se describe en la primera aplicación.

En la cuarta aplicación, demostramos el análisis de colocalización para tres canales reportero. El flujo de trabajo fue el mismo que para dos canales reporteros, excepto que primero se seleccionó «3 canales reporteros» en el menú principal «Settings» (Fig. 8A). Las imágenes se obtuvieron de la Broad Bioimage Benchmark Collection (BBBC025, versión 1, conjunto de imágenes: 37983, imagen: p23_s9) de células de cáncer de hueso U2OS (n = 66)38 . Las tres imágenes reporteras tenían el ADN, el retículo endoplásmico (RE) y las mitocondrias teñidas respectivamente con Hoechst 33342, conjugado concanavalina A/Alexa Fluor488 y MitoTracker Deep Red (fila superior, Fig. 8B). La identificación de las células se realizó con una imagen de la membrana plasmática etiquetada con aglutinina de germen de trigo (WGA)/conjugado Alexa Fluor 555 (parte superior izquierda, Fig. 8B). Nota: la imagen también tenía marcados el aparato de Golgi y la red de F-actina38. La membrana plasmática se trazó utilizando la herramienta de selección de polígonos en ImageJ para crear ROIs para las células individuales, y el gestor de ROIs que contiene los ROIs se seleccionó para la identificación de las células.

Los patrones de localización se visualizaron de la misma manera que para dos reporteros, excepto que: (i) hay tres conjuntos de mapas de calor para los reporteros en lugar de dos (fila inferior, Fig. 8B); y (ii) los gráficos de dispersión y las matrices métricas están en tres dimensiones (Fig. 8C-F). Existe la opción en la pestaña de Visualización y en la pestaña de Análisis (Fig. 8G) de medir la colocalización para los tres reporteros utilizando las métricas ICQ, TOS o M1, M2 y M3 de Manders. De las tres métricas, encontramos que TOS era la más fácil de interpretar. El TOS tiene un único valor para medir la colocalización de las tres señales del reportero, y mostró claramente que las señales del reportero para el núcleo, las mitocondrias y el RE se superponían en umbrales bajos (es decir, en valores altos de FT hay colocalización; color rojo en la Fig. 8E) y no se superponían en umbrales altos (es decir, en valores bajos de FT hay anticolocalización; color azul en la Fig. 8E). Estas observaciones son consistentes con que el núcleo, las mitocondrias y los orgánulos del RE se superponen en sus bordes (donde la señal de sus reporteros es típicamente más baja) debido a las interacciones físicas conocidas, pero no en sus centros (donde la señal de sus reporteros es típicamente más alta) porque son estructuras distintas en las células39,40,41.