Ensayo de permeabilidad Caco-2

Preguntas y respuestas sobre la permeabilidad Caco-2

Por favor, proporcione una visión general del ensayo de permeabilidad Caco-2 de Cyprotex.

Las células Caco-2 se utilizan ampliamente como modelo in vitro para predecir la absorción de fármacos en humanos. La línea celular Caco-2 se deriva de un carcinoma colorrectal humano y, cuando se cultivan, las células se diferencian espontáneamente en monocapas de enterocitos polarizados.

Las células se siembran en placas de inserción multipocillo y forman una monocapa confluente durante 20 días antes del experimento. El día 20, se añade el compuesto de prueba al lado apical de la membrana y se controla el flujo del compuesto a través de la monocapa durante un período de 2 horas. Para estudiar el eflujo del fármaco, también es necesario investigar el transporte del compuesto desde el compartimento basolateral al apical.

El coeficiente de permeabilidad (Papp) se calcula a partir de la siguiente ecuación:

Donde dQ/dt es la velocidad de permeación del fármaco a través de las células, C0 es la concentración del donante en el momento cero y A es el área de la monocapa celular.

¿Cómo se interpretan los datos del ensayo de permeabilidad Caco-2?

Hay varias formas de utilizar los datos del ensayo de permeabilidad Caco-2. En primer lugar, los compuestos pueden clasificarse por sus valores Papp. Dos compuestos de referencia, el atenolol (transporte paracelular pasivo) y el propranolol (transporte transcelular pasivo) se examinan junto con los compuestos de prueba. El atenolol y el propranolol tienen una absorción humana conocida del 50% y el 90% respectivamente2,3, y pueden utilizarse como marcadores para clasificar los compuestos de prueba. En segundo lugar, los datos pueden utilizarse junto con otros parámetros in vitro para predecir la farmacocinética oral de un compuesto in vivo utilizando el software de simulación Cloe PK. En tercer lugar, los datos de Caco-2 pueden utilizarse para predecir la permeabilidad de la barrera hematoencefálica (BBB) (Figura 3).

Figura 3
Correlación entre la Pactive derivada de Caco-2 ((PappB-A – PappA-B)/2) y la tasa de permeación de la BBB in situ, logPS (producto permeabilidad-área superficial). Los fármacos que se sabe que permean la BBB (cafeína, imipramina, progesterona) tienen un logPS >-2,0 (área sombreada en verde), mientras que los fármacos que se sabe que no atraviesan la BBB (aldosterona, hidrocortisona, cimetidina) tienen un logPS ≤-3,5 (área sombreada en rosa).

Se muestra una línea de regresión que muestra una clara correlación entre Pactive y logPS para los compuestos que no están sujetos a niveles significativos de actividad de eflujo en las células Caco-2, es decir para compuestos con una Pactive de < 5 × 10 -6 cm/s. Utilizando esta correlación, el ensayo Caco-2 de Cyprotex puede utilizarse para evaluar el potencial BBB de los compuestos con Pactive < 5 × 10 -6 cm/s.

¿Cuál es la relación entre la permeabilidad de Caco-2 y la absorción intestinal humana?

La relación entre la permeabilidad de Caco-2 (utilizando tampones HBSS de pH7,4 en los compartimentos apical y basolateral) y la absorción intestinal humana se muestra en la figura 4. Esta correlación es típica de las observadas en la literatura para estos dos parámetros4. Es importante señalar que este gráfico está influenciado por la precisión de los datos de absorción intestinal. Los valores de absorción intestinal utilizados en este gráfico se han tomado de Zhao et al. 20012. En este trabajo, la absorción intestinal humana se ha extraído de varias fuentes y su calidad varía considerablemente. También se sabe que varios compuestos presentan una absorción dependiente de la dosis (mostrada por las barras de error en el gráfico).

Figura 4
Relación entre la permeabilidad de Caco-2 y el % de absorción intestinal humana.

¿Cuáles son las diferencias entre el PAMPA y el ensayo de permeabilidad de Caco-2?

La pantalla de permeabilidad de Caco-2 se considera más representativa de la absorción humana in vivo que el PAMPA (ensayo de permeabilidad de membrana artificial paralelo). El PAMPA sólo proporciona una medida de la difusión pasiva, mientras que el modelo Caco-2 ofrece una mejor predicción de la absorción humana de los compuestos que muestran una captación o un eflujo activos o que atraviesan la membrana por la vía paracelular. La información de ambos ensayos utilizada conjuntamente puede ser valiosa para identificar la causa principal de la mala absorción.

¿Cómo se mide el eflujo del fármaco?

Se realiza un ensayo de permeabilidad bidireccional en Caco-2 en el que el transporte del compuesto se mide en la dirección apical a basolateral, así como en la dirección basolateral a apical. El resultado se suele comunicar como una relación de eflujo, es decir, Papp(B-A)/Papp(A-B). Si la relación de eflujo es superior a dos, esto indica que se está produciendo el eflujo del fármaco. El talinolol, un sustrato conocido de la P-gp, se analiza como compuesto de control para confirmar que las células expresan proteínas transportadoras de eflujo funcionales.

¿Cómo se sabe si las células han formado una monocapa confluente?

La medición de la resistencia eléctrica transepitelial (TEER) se utiliza para determinar la formación de uniones estrechas entre las células. Además, el amarillo lucifer, un marcador de integridad de la membrana, se coincuba con el compuesto de prueba al comienzo del experimento. Si la Papp del amarillo lucifer supera 1,0 × 10 -6 cm/s en un pocillo, pero el resultado de la Papp derivada del compuesto de ensayo o del compuesto de control en ese pocillo es cualitativamente similar al determinado en el resto de los pocillos replicados (dentro del umbral del amarillo lucifer), entonces, según el criterio científico del científico responsable, la monocapa celular puede considerarse aceptable. Si no es así, se excluye el resultado de la monocapa afectada y se informa de un resultado n=1, o se puede volver a probar el compuesto. Si ambas réplicas están afectadas, se vuelve a analizar el compuesto. Si ambos valores de Papp de amarillo lucifer fallan para el mismo compuesto en dos ocasiones distintas, se asume que el compuesto presenta efectos citotóxicos contra las células Caco-2 o fluorescencia inherente.

¿Cómo y por qué se calcula el % de recuperación?

El % de recuperación puede ser útil para interpretar los datos de Caco-2. Si la recuperación es muy baja, esto puede indicar problemas de mala solubilidad, de unión del compuesto a la placa, de metabolismo por parte de las células Caco-2 o de acumulación del compuesto en la monocapa celular.