Electroporación y métodos de transfección competidores

Además de la introducción directa de genes, la electroporación facilita la transferencia directa de plásmidos entre células o especies, por ejemplo, de bacterias a levaduras.

Se sigue experimentando ampliamente con el uso de la electroporación para suministrar medicamentos y vacunas directamente a las células de los organismos vivos. Este artículo se centra en las aplicaciones no médicas.

La electroporación se utiliza más comúnmente para transfectar células de forma transitoria, aunque también es posible la transfección estable. En la industria biofarmacéutica, la transfección transitoria permite la producción de hasta unos pocos gramos de proteína para la caracterización y los estudios preclínicos. En esta aplicación, la electroporación utilizando plásmidos ha demostrado ser fiable y predecible. La electroporación produce igualmente células transfectadas de forma estable siempre que el ADN se introduzca en forma linealizada tratándolo primero con una enzima de restricción.

Una técnica entre muchas

La electroporación está firmemente establecida en el arsenal de técnicas de transfección que incluyen los vectores virales, los métodos químicos o basados en reactivos y la entrega mecánica de genes. Los vectores virales son el método más común para generar células transfectadas de forma estable para la fabricación de proteínas terapéuticas. Los vectores virales proporcionan una eficacia de transfección muy alta, pero están limitados en cuanto a la longitud del ADN insertado. Los vectores virales también se enfrentan a problemas relacionados con la bioseguridad y la mutagénesis.

También se emplean experimentalmente otras técnicas mecánicas como la microprecipitación, la microinyección, los liposomas, el bombardeo de partículas, la sonoporación, la poración inducida por láser y la transfección con perlas. Estas técnicas mecánicas tienen un hilo conductor. Perturban las membranas celulares y, por tanto, permiten que el ADN entre en la célula. Algunos enfoques -la «pistola de genes», por ejemplo- implican la proyección de genes directamente a través de la membrana hacia el citoplasma. Desde aquí, los genes pueden migrar al núcleo.

Además, existen técnicas híbridas que explotan las capacidades de los métodos de transfección mecánica y química. Por ejemplo, en la última década han aparecido numerosos artículos sobre la magnetofección, una metodología de transfección que combina la transfección química con los métodos mecánicos. Por ejemplo, los lípidos catiónicos pueden utilizarse en combinación con pistolas de genes o electroporadores. La mayor parte de la bibliografía sobre magnetofección se refiere a la administración de genes y moléculas terapéuticas a organismos vivos.

La electroporación tiene varias ventajas: versatilidad (funciona con cualquier tipo de célula), eficacia, requisitos de ADN muy bajos y la capacidad de operar en organismos vivos. Las desventajas incluyen el posible daño celular y el transporte inespecífico de moléculas dentro y fuera de la célula.

Pero entre los enfoques de transfección química, mecánica y viral, la electroporación por sí sola proporciona una certeza razonable de éxito independientemente de la célula u organismo objetivo.

Por ejemplo, la transformación química y la electroporación son dos métodos principales para introducir ADN en Escherichia coli. En el caso de la electroporación, primero hay que hacer que las bacterias sean «competentes» eliminando las sales del tampón para asegurar que la corriente llegue a las células, seguido de la aplicación del impulso eléctrico a 0°C para reducir el daño a los microorganismos. La transformación química implica la suspensión en CaCl2, que crea poros, seguida de un choque térmico que introduce el ADN en las células.

Otro enfoque utiliza lípidos catiónicos para abrir las membranas celulares. La electroporación es menos engorrosa y más eficiente, funciona en tipos celulares más variados y se presta más fácilmente a métodos estándar que la transfección química. Sin embargo, algunos investigadores prefieren la transformación química porque no requiere la compra de un instrumento.

Permitir la innovación

Aunque se describió por primera vez en 1965, la electroporación sigue abriendo vías hacia una ciencia innovadora en términos de instrumentación, protocolos y experimentos. Al menos una docena de grupos universitarios han desarrollado dispositivos de electroporación basados en sistemas microelectromecánicos (MEMS). Una de las ventajas de los dispositivos con microcanales es que pueden diseñarse para no aplicar más voltaje que el suficiente para lograr una incorporación razonable de macromoléculas. Esta ventaja es también un inconveniente. A diferencia de los sistemas de electroporación comerciales, los chips no funcionan con todas las células.

Un grupo del Departamento de Ingeniería Biomédica de la Universidad Tecnológica de Luisiana, dirigido por el doctor Shengnian Wang, ha descubierto que las nanopartículas de oro mejoran el rendimiento de los equipos de electroporación comerciales.1 Wang cree que las partículas, que son altamente conductoras, reducen la conductividad del medio celular al tiempo que actúan como «microelectrodos virtuales» para ayudar a abrir las membranas de fosfolípidos. Afirma que el rendimiento es mayor (mejora de la eficacia del suministro de ADN) y que la viabilidad de las células es mayor gracias a los menores voltajes de poración.

Investigadores de la Charité Universitätsmedizin Berlin2 han desarrollado una estrategia de electroporación combinada de pulsos cuadrados para la transfección reproducible de células. La doctora Britta Siegmund y sus colaboradores suspenden las células en un tampón y las someten a un pulso inicial de alto voltaje seguido de un pulso de bajo voltaje de diferente valor eléctrico y temporal. La Dra. Siegmund afirma que la viabilidad es comparable a la de la electroporación estándar y que la eficacia de la transfección es de hasta el 95%. Concluye que la técnica puede «adaptarse fácilmente a las células consideradas difíciles de transfectar».

Además de la transferencia común de ADN, la transfección se ha empleado para introducir ARN interferente en varios tipos de células. La técnica permite el estudio controlado y a pequeña escala de la eficacia de la dosificación y la entrega. Los problemas de dosificación y administración han sido un obstáculo para las aplicaciones terapéuticas prácticas del ARN de interferencia. Pero al menos un estudio ha cuestionado si los genes de ARN de interferencia se incorporan de forma más eficaz a través de reactivos de transfección o de la electroporación en células primarias.3

La doctora Kirsty Jensen y sus colegas de la Universidad de Edimburgo compararon la eficacia de 11 kits de reactivos de transfección transitoria y de la electroporación para el silenciamiento del gen inmunomodulador de la fiebre mediterránea (MEFV) en macrófagos bovinos derivados de monocitos. El grupo probó las metodologías para la captación del ARN de interferencia pequeño, la eliminación del gen diana, la toxicidad celular y la inducción de la respuesta del interferón de tipo I.

La electroporación fue aproximadamente tan eficaz para eliminar el MEFV como los reactivos de transfección. A diferencia de los reactivos, la electroporación no indujo ninguna respuesta de interferón, pero la viabilidad celular fue menor. Las cuestiones de la viabilidad y la eficacia de la transfección para la electroporación se toman generalmente como una evaluación del valor nominal de la técnica.

El Dr. Jensen llegó a la conclusión de que «el uso de reactivos de transfección es más adecuado que la electroporación para nuestro trabajo de investigación del papel de los genes de los macrófagos del huésped en la respuesta a la infección», pero que «la elección de la transfección o la electroporación de ARN interferente pequeño en las células depende de los experimentos individuales.»

En al menos algunos casos en los que los resultados de la electroporación no son óptimos, los investigadores han descuidado la optimización de las condiciones, aparte de la fuerza del pulso eléctrico. Como han señalado recientemente Hu y colaboradores,4 la eficacia de la electroporación está influida por factores no eléctricos como el tipo de célula o tejido y la formulación del ADN.

La electroporación se ha convertido en un método indispensable para la biología del desarrollo tanto in vitro como in vivo. Una buena parte de este trabajo tiene lugar en células individuales, lo que contribuye a un modelo de gran interés en la terapéutica, el diagnóstico, la administración de fármacos y la biología celular. La nanoporación directa de células individuales es difícil debido a la incertidumbre inherente a la viabilidad posterior a laporación.

Investigadores de la Universidad de Northwestern han desarrollado una técnica de células individuales que proporciona una alta viabilidad y eficiencia.5 Su enfoque utiliza un dispositivo en voladizo microfabricado, la sonda de nanofuentes (NFP). Este dispositivo suministra moléculas a las células con más suavidad que la microinyección a granel o la nanoporación. Los investigadores han demostrado la electroporación mediada por NFP de células HeLa individuales con una eficacia de transfección superior al 95%, una viabilidad del 92% y un control cualitativo de la dosis.

Las NFP representan una mejora respecto a las antiguas tecnologías de transfección que emplean sondas de microscopio de fuerza atómica. Las técnicas basadas en la microscopía de fuerza atómica a menudo hacen que las células pierdan adherencia o se rompan. Los PFN infligen menos daño a las células.