Echovirus 4 asociado a la enfermedad de manos, pies y boca

VIROLOGÍA

Echovirus 4 asociado a la enfermedad de manos, pies y boca

Echovirus 4 asociado a la enfermedad de manos, pies y boca

Denise Hage Russo; Adriana Luchs; Bráulio Caetano Machado; Rita de Cássia Carmona; Maria do Carmo Sampaio Timenetsky

Laboratorio de Virus Entéricos, Instituto Adolfo Lutz, São Paulo, SP, Brasil

Correspondencia a

Sumario

La enfermedad de manos, pies y boca (EMH) es una infección enteroviral contagiosa que se presenta principalmente en niños y se caracteriza por erupciones vesiculares palmoplantar y estomatitis erosiva. El Ecovirus 4 (EV-4) se ha asociado comúnmente con la meningitis aséptica. La asociación de la HFMD con el EV-4 no se había comunicado anteriormente. Se enviaron al Laboratorio de Virus Entéricos del Instituto Adolfo Lutz dos muestras de un niño de 14 meses que presentaba fiebre leve, llagas en la boca y erupción con ampollas en la palma de las manos y la planta de los pies. Las muestras clínicas fueron inoculadas en tres líneas celulares diferentes, y las que presentaron efecto citopático (ECP), fueron sometidas a Ensayo de Inmunofluorescencia Indirecta (IFA) y RT-PCR «one step». La electroforesis en gel de agarosa del producto de la RT-PCR, mostró un producto de 437 pb, característico del grupo de los enterovirus. El Echovirus 4 fue identificado por IFA. Aunque la HFMD es una infección viral asociada principalmente al Enterovirus 71 (HEV-71) y al Coxsackievirus A16 (CV-A16), nuestros resultados demuestran una diversidad de serotipos relacionados con la HFMD y subrayan la importancia de la vigilancia epidemiológica de esta enfermedad y sus complicaciones.

Palabras clave: Enfermedad de manos, pies y boca; Enterovirus; Echovirus.

RESUMEN

La enfermedad de manos, pies y boca (DMPB) es una infección enteroviral contagiosa que ocurre principalmente en niños y se caracteriza por erupciones palmoplantares vesiculares y estomatitis. El Echovirus 4 (EV-4) está comúnmente asociado a la meningitis aséptica. La asociación de DMPB por EV-4 no se ha descrito previamente. Se enviaron al Laboratorio de Virus Entéricos del Instituto Adolfo Lutz dos muestras de un niño de 14 meses que presentaba fiebre, secreciones en la garganta y erupciones en las palmas de las manos y los pies. Las muestras se inocularon en tres líneas celulares diferentes; las que presentaron efecto citopático (ECP), se sometieron a un ensayo de inmunofluorescencia indirecta (IFI) y a una RT-PCR de «un paso». La electroforesis en gel de agarosa realizada con el producto de la PCR mostró un producto de 437pb, característico del grupo Enterovirus. El serotipo EV-4 fue identificado por IFI. Aunque la DMPB es una infección vírica asociada principalmente al Enterovirus 71 (HEV-71) y al Coxsackievirus A16 (CV-A16), nuestros resultados subrayan la necesidad de realizar estudios epidemiológicos y de laboratorio dirigidos al EV-4 como agente causal de la DMPB.

INTRODUCCIÓN

La enfermedad de manos, pies y boca (HFMD) es una enfermedad común de bebés y niños menores de 10 años y se caracteriza por fiebre, llagas en la boca y erupción con ampollas. La EMPB comienza con fiebre leve, falta de apetito, malestar general y, con frecuencia, dolor de garganta. Uno o dos días después, se observa fiebre y la aparición de llagas en la boca. Es habitual que aparezcan pequeñas manchas rojas con ampollas que se convierten en úlceras. Suelen localizarse en la lengua, las encías y el interior de las mejillas. La erupción cutánea se desarrolla a lo largo de 1-2 días con manchas rojas planas o elevadas, y algunas con ampollas. La erupción no pica y suele localizarse en las palmas de las manos y las plantas de los pies. También aparece en las nalgas. Aunque, algunas personas con HFMD pueden tener sólo sarpullido o úlceras en la boca4.

La transmisión se produce de persona a persona por contacto directo con las secreciones de la nariz y la garganta o por vía oral fecal. La HFMD no se transmite a los animales domésticos ni a otros animales. Se producen casos individuales de HFMD en todo el mundo, con mayor frecuencia en verano y a principios de otoño4. También se produce un contagio vertical de la madre al feto pero, los casos se resuelven sin complicaciones a largo plazo, la infección en el primer trimestre puede provocar un aborto espontáneo o un retraso del crecimiento intrauterino. Se han notificado otras complicaciones, como miocarditis, meningoencefalitis, edema pulmonar e incluso la muerte16.

El primer informe de HFMD fue realizado por ROBINSON & RHODES en 195812. Informaron de un exantema con fiebre y lesiones orales asociadas, observado en más de 60 personas en junio y julio de 1957 en Toronto, Canadá. El Coxsackievirus A16 (CV-A16) se aisló en dos tercios de las 27 muestras de heces estudiadas. La siguiente epidemia de Coxsackievirus de la que se informó se produjo en Birmingham, Inglaterra, en el verano de 1960 y fue descrita por ALSOP et al.2, que observaron lesiones vesiculares en las manos y los pies con lesiones orofaríngeas y que denominaron a la erupción enfermedad de manos, pies y boca16.

La EMH está causada por enterovirus, miembros de la familia de los picornavirus (ARN monocatenario, sin envoltura) y se asocia más comúnmente con el CV-A16 o el enterovirus 71 (HEV-71). También se han notificado casos esporádicos asociados a CV-A4 a CV-A7, CV-A9, CV-A10, CV-B1 a CV-B3 y CV-B5. Las infecciones suelen ser esporádicas, pero regularmente se producen epidemias. La infección viral inicial se produce en la mucosa bucal y en la mucosa ileal y va seguida de la propagación a los ganglios linfáticos regionales en un plazo de 24 horas. La viremia sigue rápidamente y el virus se extiende a la mucosa oral y a la piel. Alrededor del séptimo día después de la infección, los niveles de anticuerpos séricos pueden empezar a aumentar 6,8.

PATIENTES Y MÉTODOS

Muestras: Durante el mes de julio de 2003 se produjo un brote de HFMD en una guardería de la ciudad de São Paulo, y se enviaron al Laboratorio de Virus Entéricos del Instituto Adolfo Lutz dos muestras de heces de un niño varón de 14 meses que era sospechoso. Presentaba fiebre, llagas en la boca, malestar general, falta de apetito y erupción en las palmas de las manos y las plantas de los pies. Otros ocho niños del mismo centro, en un rango de 10 meses a tres años de edad, presentaron síntomas similares. La HFMD fue diagnosticada por otros centros médicos (comunicación personal). Fue imposible recoger muestras de suero emparejadas para proceder a las pruebas serológicas de valoración de anticuerpos.

Aislamiento e identificación viral: Las muestras recogidas a los seis días de la vuelta, se clarificaron bajo centrifugación a 10.000 x g/60 minutos, a 4 ºC; se añadieron antibióticos (estreptomicina y penicilina ) y el sobrenadante se almacenó a -70 ºC hasta su inoculación (0,1 y 0,2 mL/tubo) en tres líneas celulares diferentes: RD (rabdomiosarcoma humano), HEp 2 (carcinoma epidérmico de laringe humano) y Vero (riñón de mono verde) que contenían medio esencial mínimo (L15 de Eagle, Eagle + AANE + piruvato y medio 199, respectivamente). Después, los tubos se mantuvieron a 35-37 ºC. Los cultivos se observaron al microscopio invertido cada día, para visualizar el efecto citopático (ECP). Se realizaron pases sucesivos del material inoculado hasta la aparición o no del ECP característico de la infección por VHE7.

Asunto de Inmunofluorescencia Indirecta – IFA: Cuando el cultivo celular presentaba al menos un 75% de ECP, se raspaba el tubo y se manchaba la suspensión celular en un portaobjetos de vidrio, que se secaba al aire y se fijaba con acetona. A continuación, se sometió a un ensayo de inmunofluorescencia indirecta (IFA), utilizando anticuerpos monoclonales específicos, disponibles comercialmente (Chemicon International Inc., Temecula, CA/USA) para el género, el grupo y los serotipos del VHE. Los pocillos de los portaobjetos se examinaron con un microscopio de epifluorescencia3.

RT-PCR: El ARN viral se extrajo del virus aislado mediante Trizol® LS (Invitrogen, cat. 1296-010) y cloroformo, según las instrucciones del fabricante. Tras la centrifugación a 12.000 xg, se separó la fase acuosa y se precipitó con alcohol isopropílico. El pellet de ARN se lavó con etanol al 75%. Al final del procedimiento, el ARN se secó brevemente y se resuspendió con agua Milli-Q; se añadió RNAsin y el ARN se almacenó a -70 ºC. El ADNc se sintetizó utilizando el ARN extraído y la mezcla 50 mM de MgCl2; 10x de tampón de PCR; 1,25 nM de dNTP; 20 µM/µL de cebador AS1/S1; 2 µL de transcriptasa inversa de ARNse Super Script II; 2,5 U/µL de TaqQ DNA Polymerase; 40 U/µL de RNAsin y agua Milli-Q. Las reacciones de amplificación se realizaron en el termociclador Gene Amp PCR System 9600 Perkin Elmer con la siguiente programación (42 ºC/1h) + (95 ºC/5 min) + 25 ciclos (94 ºC/1 min + 50 ºC/2 min + 72 ºC/1min) + (72 ºC/7min). Los productos de la PCR se separaron en un gel de agarosa al 1,5%, se tiñeron con bromuro de etidio y se visualizaron bajo luz UV. Los cebadores dirigidos a la región 5’no traducida amplificaron un producto de 437bp13.

RESULTADOS

CPE sugestivos de VHE: redondeo, contracción, picnosis nuclear, refractilidad y degeneración celular fueron sensibles a las células RD y Vero. El tiempo para informar de los cultivos positivos fue de unos 4-7 días.

En el microscopio de epifluorescencia, a 400x, pudo observarse una fluorescencia verde manzana brillante en el núcleo y/o el citoplasma de las células, lo que indica una reacción positiva al serotipo 4 de echovirus. La IFA fue negativa a los otros anticuerpos monoclonales.

Se aplicó la RTPCR para confirmar el género del VHE. La electroforesis en gel de agarosa mostró un producto de 437 pb, que identificaba al VHE (Fig. 1).

DISCUSIÓN

El agente etiológico identificado en este estudio es el VHE, diferente de los otros previamente relacionados con la HFMD. Este síndrome se ha asociado comúnmente con el VC-A16 y el VHE-71 mientras que no se ha encontrado en la literatura ningún dato epidemiológico sobre el VHE-4 asociado a la HFMD.

Mientras tanto, el brote de HFMD ocurrido en Malasia (1997) se asoció a EV-1, CV-A9 y HEV-711. La HFMD causada por el HEV-71 se ha asociado con casos mortales de encefalitis durante los brotes de Malasia (1997) y Taiwán (1998)17. El VHE-7 se encontró durante la última parte del año 2000, además del VC-A16 y el VHE-7, como agente etiológico de la HFMD5. En Brasil, MOREIRA et al., (1995) relataron una enfermedad exantemática epidémica asociada al coxsackievirus B3 (CV-B3)10. En Brasil no se relaciona ningún informe sobre la asociación con EV-4 y HFMD, tal vez debido a la falta de sospechas clínicas.

El EV-4 se relaciona generalmente con meningitis aséptica, encefalitis, parálisis, síndrome de Güillan-Barré, exantema y enfermedades respiratorias y se ha encontrado en todo el mundo, principalmente como causa de brotes de meningitis aséptica: en Cuba, de 1972 a 1999; en Ciudad del Cabo, Sudáfrica, de 1981 a 1989; en abril de 1997 en regiones de Israel y la Autoridad Palestina; en España durante 1988 a 2003; en otoño de 1982 en Polonia, y en Vellore y sus alrededores en la India en 20028,9,11,14,15,18.

Típicamente, las infecciones por enterovirus son asintomáticas o dan lugar a una enfermedad leve. Por ello, se recomienda recoger muestras de suero para proceder a la valoración de anticuerpos mediante la técnica de microneutralización, lo que sería un parámetro más para confirmar que el virus aislado es el responsable de la enfermedad. Asociado al aislamiento fecal, el aumento de cuatro veces de la titulación de suero (seroconversión) confirma la infección aguda. Lamentablemente, en este estudio no fue posible obtener muestras de suero.

A pesar de, todos los otros ocho niños fueron diagnosticados como HFMD por los centros médicos, basado en los signos clínicos.

Aunque este resultado podría no ser suficiente para afirmar que el EV-4 era una causa de la enfermedad, parecía razonable concluir que las señales y manifestaciones clínicas evidentes confirman la hipótesis de que el virus no es un virus pasajero.

Es importante acentuar que el CV-A16 y el HEV-71, conocidos como la causa principal de la HFMD, suelen producir CPE en cultivos de células RD, HEp2 y Vero; pero en este estudio no fueron identificados.

Nuestro trabajo demuestra que el VHE-4 es un agente causal de la HFMD y sugiere la posibilidad de que otros serotipos del VHE, puedan estar eventualmente relacionados con los casos de HFMD. Este informe de caso enfatiza la necesidad de intensificar los estudios epidemiológicos y de laboratorio sobre este serotipo y la vigilancia de otros serotipos del VHE implicados en la HFMD, debe ser incrementada en Brasil.

AGRADECIMIENTOS

Estamos especialmente agradecidos al Dr. Luís Florêncio Salles Gomes por sus sugerencias y críticas sobre este trabajo.

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