Diferenciación genómica y estructura poblacional intercontinental de los mosquitos vectores Culex pipiens pipiens y Culex pipiens molestus

Origen monofilético independiente de Culex pipiens pipiens y Culex pipiens molestus

Se han propuesto dos hipótesis alternativas para explicar las diferencias en las estrategias ecológicas y fisiológicas de Cx. p. pipiens y Cx. p. molestus19. Una hipótesis explica dicha diferenciación como un rápido cambio en los rasgos fisiológicos y de comportamiento como adaptación a un entorno subterráneo que está asociado a las actividades humanas22. En esta hipótesis, las poblaciones locales de Cx. p. molestus deben estar estrechamente relacionadas con las poblaciones locales de Cx. p. pipiens30. Esta hipótesis considera a Cx. p. molestus como una variante ecofisiológica de Cx. p. pipiens. Una hipótesis alternativa sugiere que la diferencia entre Cx. p. pipiens y Cx. p. molestus es resultado de la distinción en su historia evolutiva. Las estrategias ecológicas y fisiológicas de Cx. p. molestus podrían haber surgido primero bajo el clima cálido19. Más tarde, dicha estrategia pareció ser relevante debido a las actividades humanas que crearon un entorno subterráneo y, por tanto, extendieron Cx. p. molestus por todo el mundo. Esta hipótesis considera a Cx. p. molestus y Cx. p. pipiens como entidades evolutivas separadas.

En nuestro estudio, pusimos a prueba estas hipótesis utilizando el análisis del genoma completo de 40 muestras de Cx. p. molestus y Cx. p. pipiens recogidas en cuatro lugares de Eurasia y Norteamérica. Nuestros resultados rechazaron la hipótesis de la reemergencia de Cx. p. molestus a partir de las poblaciones locales de Cx. p. pipiens y apoyaron firmemente la idea de un origen monofilético independiente tanto de Cx. p. pipiens como de Cx. p. molestus de diferentes continentes. Los análisis NJ y ML agrupan por separado a Cx. p. pipiens y Cx. p. molestus de la República de Bielorrusia, la República Kirguisa y Chicago, IL, EE.UU. (Fig. 2, Figs. suplementarias 1-3). La presencia de un grupo híbrido adicional formado por especímenes autogénicos y anautogénicos recogidos en el campo en Washington, D.C., EE.UU., refleja más probablemente la existencia de una zona híbrida Cx. pipiens – Cx. quinquefasciatus en esta área16. Sin embargo, basándose en las distancias genéticas, este grupo está mucho más relacionado con el Cx. p. pipiens euroasiático que con el Cx. p. molestus de Eurasia y EE.UU. (Chicago, IL). Además, los análisis PCA (Fig. 3) y ADMIXTURE (Fig. 4) identificaron dos grupos genéticos distintos que corresponden a Cx. p. pipiens y Cx. p. molestus. En ambos casos, todos los especímenes de Washington, D.C. se agruparon con Cx. p. pipiens de otras localidades. Los valores Fst por pares a nivel del genoma fueron altamente significativos para todas las comparaciones (Fig. 5). No identificamos ninguna región específica de alta divergencia en el genoma (Fig. 6). En general, los valores de Fst fueron mucho más altos entre Cx. p. molestus y Cx. p. pipiens que entre las muestras autógenas y anautogénicas de Cx. p. pipiens de Washington, D.C. El grupo más divergente, basado en todos los análisis realizados, fue la cepa de Cx. p. molestus de Chicago, IL, lo que puede explicarse por la muy baja diversidad genética de esta cepa causada por su larga colonización y posible cuello de botella, que aceleró la deriva genética (Fig. 7).

Observaciones similares sobre el origen monofilético independiente de Cx. p. molestus y Cx. p. pipiens se obtuvieron utilizando el análisis de microsatélites en ~600 muestras de mosquitos Cx. pipiens derivadas de diferentes lugares del mundo19. El procedimiento de árbol de distancia sin raíz agrupó por separado a las poblaciones aéreas de Cx. p. pipiens y a las poblaciones subterráneas de Cx. p. molestus del norte y del sur de Europa. Al igual que en nuestro estudio, las poblaciones aéreas de Cx. p. pipiens de EE.UU. formaron un grupo adicional que sugiere una hibridación más intensa entre los miembros del complejo Cx. pipiens en Norteamérica. El análisis de mezcla indicó la presencia de tres grupos principales que corresponden a Cx. p. molestus, Cx. p. pipiens y Cx. quinquefasciatus. Este último clúster se encontró en este estudio sólo en las muestras de Estados Unidos. Otro trabajo basado en análisis de polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados (AFLP) comparó muestras del sur y el norte de Europa y cepas de Chicago, IL, Estados Unidos24. Las poblaciones norteamericanas y europeas utilizadas en este estudio mostraron un patrón de ADMIXTURA similar en el análisis del genoma AFLP. El análisis de los genes COI también indicó un origen monofilético de Cx. p. pipiens y Cx. p. molestus en Europa, Asia y África26.

Por tanto, el origen monofilético independiente y el alto nivel de divergencia genética entre Cx. p. molestus y Cx. p. pipiens sugieren que estos dos miembros del complejo Cx. pipiens representan entidades filogenéticas distintas con historias evolutivas independientes antes de la translocación mediada por el hombre.

Conceptos de especiación y evolución del complejo Culex pipiens

Los modelos teóricos de especiación en animales podrían subdividirse en dos grandes grupos: especiación alopátrica o geográfica y especiación simpátrica o ecológica. El primer concepto de especiación, promovido intensamente por E. Mayr3, sugiere que los taxones incipientes primero se aíslan geográficamente. Esta situación reduce el flujo de genes entre las poblaciones y puede conducir a la acumulación de mutaciones que causan incompatibilidad genética entre los híbridos. Un concepto alternativo de la especiación hace hincapié en las barreras ecológicas entre los taxones emergentes como principales impulsores de la evolución31. Este escenario considera el desarrollo del aislamiento reproductivo entre las poblaciones como resultado de la adaptación a entornos diferentes sin aislamiento geográfico, que suele tener lugar ante el flujo de genes. En esta situación, los híbridos entre taxones incipientes se vuelven menos aptos para el entorno, lo que promueve la selección natural de cualquier rasgo que reduzca el apareamiento entre ellos. Creemos que la diversificación global de las subespecies Cx. p. pipiens y Cx. p. molestus representa un ejemplo sorprendente de especiación mediante mecanismos de aislamiento por ecología. En nuestro estudio, el análisis Fst determinó niveles significativos de divergencia genómica entre Cx. p. pipiens y Cx. p. molestus (Figs. 5 y 6) en todo el genoma sin islas claras de especiación. Sorprendentemente, los niveles de diferenciación fueron menores alrededor de los centrómeros, probablemente debido al bajo número de SNVs fiables en estas regiones altamente repetitivas. La diferenciación fue extremadamente alta entre las cepas de Cx. p. pipiens y Cx. p. molestus de Chicago, IL, EE.UU., pero fue menor entre las subespecies de las colecciones de mosquitos de Eurasia. En general, estas observaciones sugieren una restricción significativa del flujo genético entre las subespecies.

Se han descrito varios mecanismos de aislamiento reproductivo entre Cx. p. pipiens y Cx. p. molestus17. Dos de ellos son de actuación precigótica, antes de la fecundación, y reducen las oportunidades de apareamiento del mosquito. El primer mecanismo está relacionado con la especialización del hábitat de las larvas: Cx. p. molestus ocupa sótanos u otros entornos subterráneos, pero Cx. p. pipiens prefiere las masas de agua abiertas por encima del suelo para criar. Esto reduce las posibilidades de que las dos subespecies se encuentren y se apareen en la fase adulta. El segundo mecanismo de aislamiento se basa en las diferencias en el comportamiento de apareamiento entre Cx. p. molestus y Cx. p. pipiens. Los machos de Cx. p. molestus suelen formar enjambres homogéneos cerca del suelo y requieren un espacio limitado para aparearse17. Por el contrario, los machos de Cx. p. pipiens forman enjambres cerca del follaje a unos 2-3 m por encima del suelo. Los estudios experimentales sobre el comportamiento de apareamiento en pequeñas jaulas indicaron que en los cruces de hembras y machos de Cx. p. molestus el éxito de la cópula era del 90%, pero en Cx. p. pipiens era sólo del 3,3%32. En los cruces entre subespecies de Cx. p. molestus y Cx. p. pipiens, el éxito de la cópula también fue bajo y varió entre el 6,6% y el 10% dependiendo de los sexos de las subespecies. Este estudio demostró que las hembras de ambas subespecies evitan activamente la cópula con los machos de una subespecie alternativa. Además, las hembras de Cx. p. pipiens no consiguieron recibir el esperma de Cx. p. molestus y, en consecuencia, no produjeron huevos.

Otros dos mecanismos de aislamiento reproductivo descritos para Cx. p. pipiens y Cx. p. molestus son postzigóticos, actúan después del apareamiento y dan lugar a una disminución de la aptitud de los híbridos. Uno de los mecanismos está relacionado con la herencia de la diapausa en los híbridos de Cx. p. molestus y Cx. p. pipiens como rasgo recesivo8. Los híbridos F1 y una parte importante de los híbridos F2 son incapaces de desarrollar la diapausa y no pueden sobrevivir en condiciones invernales. Este mecanismo, quizás, podría explicar los mayores niveles de introgresión en Cx. p. pipiens en lugares del sur19,23,24. Por último, los miembros del complejo Cx. pipiens están expuestos a la incompatibilidad citoplasmática de los híbridos infectados con diferentes cepas del parásito rickettsial Wolbachia pipientis. A pesar de la introgresión citoplasmática de este parásito a través de la hibridación entre los miembros del complejo Cx. pipiens33, la incompatibilidad citoplasmática podría limitar significativamente las tasas de supervivencia de los híbridos. Por ejemplo, la infección por W. pipientis redujo significativamente la hibridación entre Cx. pipiens y Cx. quinquefasciatus en Sudáfrica34. Otro estudio demostró que en las poblaciones euroasiáticas Cx. p. molestus sólo estaba infectado por una cepa de W. pipientis, pero Cx. p. pipiens por dos cepas diferentes35. Además, los especímenes de Cx. p. molestus y Cx. p. pipiens, que utilizamos en nuestro estudio, estaban infectados por las mismas cepas de W. pipientis en el sur de la República de Kirguistán, pero por cepas diferentes en el norte de la República de Bielorrusia. Por lo tanto, puede explicar las diferencias en la introgresión de Cx. p. molestus a Cx. p. pipiens que fue más pronunciada en la República de Bielorrusia que en la República de Kirguistán. De hecho, se ha descrito un ejemplo interesante de especiación infecciosa en el complejo sudamericano Drosophila paulistorum. En este complejo, seis semiespecies con distribución geográfica superpuesta se aislaron reproductivamente como resultado del aislamiento prematrimonial y postmatrimonial desencadenado por la infección de Wolbachiae36.

Estudios genómicos recientes llevados a cabo en diferentes organismos, incluyendo Drosophila simulans37, las moscas de la fruta Rhagoletis38,39 y las mariposas Heliconius40,41 proporcionan pruebas adicionales de que la especiación ecológica se produce en la naturaleza. Los patrones genómicos de especiación pueden ser muy diferentes2 y van desde pequeñas islas genómicas de especiación40 hasta niveles significativos de divergencia en todo el genoma. Se identificó una divergencia genómica generalizada entre las especies incipientes Anopheles gambiae y An. coluzzii en el complejo An. gambiae42. Estas especies se identificaron originalmente por las diferencias en la estructura de su ADN ribosómico como formas S y M43, pero posteriormente su estatus taxonómico se elevó al nivel de especie44. Se cree que An. gambiae y An. coluzzii desarrollan barreras reproductivas en simpatría como resultado de las diferencias en sus preferencias ecológicas45. La fase larvaria de An. gambiae está asociada a pequeños estanques de lluvia. En cambio, An. coluzzi explota los depósitos de agua persistentes asociados al cultivo del arroz. Aunque, las barreras precigóticas entre las especies son incompletas46, desarrollaron diferencias en su comportamiento de enjambre47,48 y tipos de canto divergentes49.

Por lo tanto, un alto nivel de divergencia en todo el genoma, una sorprendente diferencia en la adaptación a entornos ecológicos distintos y la evidencia de barreras precigóticas y postcigóticas para el apareamiento sugieren que Cx. p. pipiens y Cx. p. molestus representan unidades ecológicas distintas que sufren una especiación ecológica incipiente.

La hibridación en el complejo Culex pipiens

La observación más intrigante de los miembros del complejo Cx. pipiens es que, a pesar de las diferencias en la ecología, la fisiología, el comportamiento y la distribución geográfica, todavía pueden hibridarse y producir progenie viable en la naturaleza, lo que indica que el aislamiento reproductivo entre ellos no es completo. Nuestro estudio también demostró eventos de hibridación significativos entre las subespecies Cx. p. molestus y Cx. p. pipiens. La comparación del genoma completo indicó que la mayoría de las muestras de Cx. p. pipiens representan individuos con algún nivel de introgresión desde Cx. p. molestus (Fig. 4). Observamos una gran discrepancia entre las filogenias nuclear y mitocondrial (Figs. 2, 8), lo que indica que, históricamente, la transmisión de los genomas mitocondriales puede darse entre las subespecies. Al mismo tiempo, no observamos haplogrupos compartidos entre las poblaciones locales de las subespecies. En los continentes, todas las filogenias mitocondriales eran fuertemente monofiléticas, lo que apunta a una dispersión e hibridación mediada por los machos. La mezcla con Cx. p. molestus fue mayor en las poblaciones meridionales de Cx. p. pipiens en la República de Kirguistán y en Washington, D.C., EE.UU., pero menor en las poblaciones septentrionales de la República de Bielorrusia y Chicago, IL, EE.UU.. Esto podría estar relacionado con la incapacidad de los híbridos para desarrollar la diapausa en climas fríos. A modo de comparación, el análisis de microsatélites reveló un modesto nivel de hibridación entre Cx. p. pipiens y Cx. p. molestus de ~8% en las ciudades del norte de EE.UU. (Chicago, IL y Nueva York, NY)30,50. En el sur de Europa, donde tanto Cx. p. pipiens como Cx. p. molestus pueden encontrarse en la superficie, los niveles de hibridación entre ellos fueron similares y se estimaron en un 8-10%51. Se encontraron niveles de hibridación mucho más altos en las poblaciones del sur del este de EE.UU., donde se identificaron como híbridos entre Cx. p. molestus y Cx. p. pipiens el ~40% de todas las muestras19. Por lo tanto, las tasas de hibridación global entre los miembros de Cx. pipiens fueron mayores en Norteamérica que en el Viejo Mundo. A modo de comparación, la hibridación entre especies crípticas del complejo An. gambiae (An. gambiae y An. coluzzi) varió significativamente entre el 1% en Malí46 y el >20% en Guinea Bissau52, lo que es comparable a los niveles generales de hibridación entre Cx. p. molestus y Cx. p. pipiens.

Intrigantemente, en nuestro estudio, no determinamos una firma de mezcla de Cx. p. pipiens en ninguna muestra de Cx. p. molestus de la República de Bielorrusia, la República de Kirguistán y Chicago, IL, EE.UU. (Fig. 4). Estos resultados demuestran un flujo genético muy limitado o nulo de Cx. p. pipiens a Cx. p. molestus. Estudios anteriores mostraron resultados similares de introgresión asimétrica de Cx. p. molestus a Cx. p. pipiens20,51. El mecanismo de la introgresión asimétrica es actualmente desconocido. Una hipótesis sugiere que los machos de Cx. p. molestus, que pueden aparearse en espacios reducidos, pueden hibridarse tanto con hembras de Cx. p. molestus como de Cx. p. pipiens. En cambio, Cx. p. Los machos de Cx. p. pipiens, que requieren espacio para enjambrar, tienen una mayor disposición a aparearse con las hembras de Cx. p. pipiens51. Sin embargo, se necesitan más estudios genéticos poblacionales y experimentales para explicar este fenómeno.

Por último, nuestro estudio demostró que Cx. p. pipiens puede desarrollar autogenia como resultado de la introgresión adaptativa del material genético de Cx. p. molestus. Seleccionamos mosquitos para la autogenia en muestras recogidas en el campo en ambientes aéreos y subterráneos en Washington, D.C., Estados Unidos. Los mosquitos subterráneos eran autogénicos, pero los mosquitos de la superficie eran anautogénicos. Sin embargo, los mosquitos de las colonias autogénicas y anautogénicas formaron un único cluster cuando se aplicó el análisis de unión de vecinos (Fig. 2). Además, los enfoques PCA (Fig. 3) y ADMIXTURE (Fig. 4) agrupan estas muestras junto con Cx. p. pipiens de otras localidades. Se han encontrado poblaciones con características mixtas en Europa51 y en EEUU53. En Portugal, también se encontró un patrón inusual de comportamiento de alimentación de sangre en aves en Cx. p. molestus54.

Por lo tanto, la presencia de hibridación en curso entre los miembros del complejo Cx. pipiens sugiere que el proceso de especiación entre ellos no se ha completado y las barreras postzigóticas de aislamiento reproductivo no están completamente formadas. En general, creemos que los miembros del complejo Cx. pipiens representan un modelo notable para estudiar diferentes aspectos de la especiación geográfica y ecológica ante el flujo genético continuo entre ellos y las adaptaciones locales a diversos entornos.