Diapédesis de neutrófilos: ¿Paracelular o transcelular?

Una de las características clásicas de la inflamación es la infiltración del tejido afectado por leucocitos polimorfonucleares (PMN). Para que esto ocurra, los PMN circulantes deben sufrir interacciones adhesivas con el endotelio que les permitan activarse, aplanarse y emigrar a través del revestimiento endotelial de los microvasos. Los determinantes moleculares de estas interacciones adhesivas se han estudiado ampliamente, y existe un consenso general sobre la secuencia de acontecimientos que conducen a que los PMN se coloquen en posición de emigrar al tejido (3, 12). Inicialmente, se produce una débil interacción adhesiva entre los PMN circulantes y el endotelio que da lugar a un movimiento salatorio de los PMN a lo largo del endotelio, fenómeno que se denomina enrollamiento. El rodamiento permite a los PMN permanecer en estrecha aposición con el endotelio y, si hay mediadores inflamatorios generados localmente, los PMN se activan. Una vez activados, los PMN forman interacciones adhesivas más fuertes con el endotelio que conducen a su detención. Posteriormente, los PMN emigran a través del endotelio. A diferencia del caso de las interacciones adhesivas iniciales (laminación y adhesión), sobre las que existe un consenso general sobre los mecanismos implicados, se sabe poco sobre los mecanismos implicados en la migración transendotelial de los PMN. Incluso la premisa básica de si los PMN emigran entre las células endoteliales (vía paracelular) o a través de las células endoteliales propiamente dichas (vía transcelular) es controvertida.

El consenso predominante sostiene que los PMN circulantes emigran del compartimento intravascular al intersticio pasando entre las células endoteliales adyacentes, es decir, utilizando una vía paracelular (11). Los estudios in vivo e in vitro realizados con microscopía electrónica y óptica han captado cómo los PMN migratorios extienden pseudópodos entre las células endoteliales para atravesar la barrera endotelial en respuesta a un gradiente quimiotáctico. Para que los PMN puedan utilizar la vía paracelular para la migración transendotelial, el acoplamiento adhesivo entre las células endoteliales adyacentes debe interrumpirse y las células endoteliales deben separarse entre sí lo suficiente como para permitir el paso de los PMN. Muchos mediadores inflamatorios utilizados para simular la inflamación in vitro pueden, per se, inducir la formación de huecos en las monocapas de células endoteliales cultivadas, es decir, la retracción de las células endoteliales. Sin embargo, dado que rara vez se observan grandes huecos entre las células endoteliales en los modelos de inflamación in vivo, este fenómeno puede representar un efecto exagerado de los mediadores inflamatorios en los sistemas in vitro. Las monocapas endoteliales cultivadas tienen un desarrollo insuficiente de las uniones de adhesión interendotelial en comparación con sus homólogas in vivo, por lo que los mediadores inflamatorios pueden producir más fácilmente la retracción de las células endoteliales in vitro que in vivo (12). El correlato in vivo de este fenómeno es el aumento de la fuga macromolecular a través de las uniones interendoteliales observado en respuesta a los mediadores inflamatorios. En conjunto, los estudios in vitro dan crédito a la idea de que las células endoteliales pueden separarse unas de otras en respuesta a los mediadores inflamatorios, aunque el grado de separación puede ser exagerado.

La evidencia de que los PMN pueden inducir la retracción de las células endoteliales procede principalmente de estudios in vitro que han abordado los mecanismos implicados en la lesión de las células endoteliales mediada por los PMN (12). Esta lesión era de naturaleza no lítica y se manifestaba como un desprendimiento de células endoteliales de monocapas cultivadas en superficies no porosas. Este desprendimiento de células endoteliales se produjo entre 3 y 6 horas después de la colocación de PMN activados en la superficie de las monocapas de células endoteliales y se ha atribuido a la elastasa derivada de los PMN. Dado que las células endoteliales desprendidas rara vez se observan en modelos de inflamación in vivo, el desprendimiento de células endoteliales mediado por PMN también parece ser una exageración de un evento in vivo debido a las condiciones experimentales impuestas in vitro. En estos sistemas (monocapas endoteliales cultivadas sobre superficies no porosas), no se permite a los PMN transmigrar y alejarse de la monocapa de células endoteliales. Por lo tanto, permanecen muy cerca de las células endoteliales y persisten en el agravamiento proteolítico de la monocapa, induciendo finalmente la retracción de las células endoteliales y su posterior desprendimiento. Si se permite que los PMN activados migren a través de las monocapas de células endoteliales, rara vez se observa una retracción y desprendimiento brutos de las células endoteliales.

La elastasa derivada de los PMN puede inducir la retracción y el desprendimiento de las células endoteliales dentro de las monocapas. Esto es análogo al uso de proteasas para expandir las células endoteliales, es decir, las células tratadas con proteasas se retraen y se desprenden del sustrato, pero después del tratamiento con inhibidores de proteasas, pueden volver a sembrarse y continuar creciendo normalmente. Curiosamente, tanto la retracción de las células endoteliales como la migración transendotelial de los PMN pueden evitarse mediante inhibidores de la proteasa (por ejemplo, la elastasa). Estas últimas observaciones indican que los PMN utilizan la elastasa endógena para inducir una retracción de las células endoteliales de magnitud suficiente para permitirles pasar entre las células endoteliales adyacentes sin dañarlas. Estudios recientes sugieren que la migración transendotelial de los PMN mediada por la elastasa es un proceso altamente regulado que no requiere la degranulación de los PMN (3). Los PMN activados no secretan elastasa en el medio extracelular, sino que movilizan la elastasa hacia la membrana y la localizan en el frente de migración, por ejemplo, en los pseudópodos que penetran entre las células endoteliales adyacentes. La observación de que la degranulación de los PMN no es necesaria para su migración transendotelial se ve respaldada por la observación de que los citoplastos de PMN (PMN anucleares desprovistos de gránulos) migran a través de las monocapas endoteliales en respuesta a un gradiente quimiotáctico con la misma eficacia que los PMN normales. Una vez más, la migración transendotelial de los citoplastos puede impedirse mediante inhibidores de la elastasa.

Las células endoteliales se mantienen unidas mediante uniones de adhesión compuestas por proteínas transmembrana (11). Por lo tanto, para que los neutrófilos pasen entre las células endoteliales, las interacciones adhesivas de estas uniones deben ser interrumpidas. Existen dos uniones de adhesión relevantes para la migración transendotelial de los PMN: las uniones de adherencia y las uniones estrechas. Las uniones adherentes consisten en complejos vasculo-endoteliales (VE)-cadherina/catenina. La VE-cadherina tiene un dominio extracelular que interactúa homotípicamente con la VE-cadherina de las células endoteliales adyacentes. El dominio citoplásmico de la VE-cadherina se asocia con β- o γ-cateninas intracelulares. Estos complejos VE-cadherina/catenina están conectados al citoesqueleto de actina a través de la α-catenina (Fig. 1A). Las uniones estrechas están formadas por múltiples proteínas transmembrana, como la ocludina y las claudinas 1 y 2, y por proteínas intracelulares asociadas, como ZO-1, -2 y -3, que unen las proteínas de la unión estrecha al citoesqueleto. De estas dos uniones adherentes, el efecto de la migración transendotelial de los PMN sobre las uniones adherentes es el que ha recibido más atención.

Estudios recientes realizados con microscopía confocal indican que las interacciones adhesivas de los PMN (adhesión y migración transendotelial) pueden provocar una alteración local de las proteínas de la unión adherente (10). Se capturaron dos poblaciones de PMN adheridas a monocapas de células endoteliales: 1) aquellas bajo las cuales no había interrupción de la continuidad de las proteínas de la unión adherente y 2) aquellas bajo las cuales había interrupción de las proteínas de la unión adherente. La interrupción de la continuidad de las uniones adherentes por parte de los PMN adherentes fue un fenómeno local, ya que las uniones adherentes más alejadas de los PMN no se vieron afectadas. Un análisis sistemático reveló que las proteínas de la unión adherente por debajo de los PMN adherentes se vieron afectadas de forma secuencial, es decir, la β-catenina se perdió antes que la VE-cadherina. Los PMN capturados en el proceso de migración transendotelial se asociaron invariablemente con la pérdida de todas las proteínas de unión de adherencia en el lugar de la migración. Una vez más, no hubo ningún efecto sobre la integridad de la unión adherente en los lugares más alejados de los PMN que migraban. Además, las pruebas de la importancia de la alteración de la unión adherente en la migración transendotelial de los PMN son las siguientes 1) in vivo, los anticuerpos contra la VE-cadherina aumentaron la emigración de los PMN, y 2) in vitro, los anticuerpos contra la VE-cadherina aumentaron la migración transendotelial de los PMN e indujeron la reorganización del citoesqueleto de actina endotelial, lo que dio lugar a la formación de huecos entre las células endoteliales.

Con respecto a los complejos de uniones estrechas, estudios recientes han realizado observaciones similares. La migración transendotelial de PMN interrumpió la continuidad de ZO-1 y -2 sólo en el lugar de penetración de PMN en las uniones interendoteliales (1). No se observaron discontinuidades generalizadas en las uniones estrechas.

Mecanismos potenciales implicados en la diapedesis paracelular

El mecanismo por el que las interacciones adhesivas PMN-célula endotelial interrumpen la unión adherente no está claro. Una posibilidad es que los PMN adherentes utilicen proteasas endógenas para degradar las proteínas de la unión adherente (Fig. 1A). Por ejemplo, los inhibidores de la elastasa fueron capaces de disminuir la extensión de la pérdida inducida por los PMN de las proteínas de la unión adherente VE-cadherina y β-catenina (2). Otros estudios (11) indican que los PMN activados pueden degradar la VE-cadherina y que un inhibidor de la elastasa puede evitar esta degradación. Además, la elastasa neutrofílica purificada produce productos de degradación de la VE-cadherina similares a los observados tras la degradación de este componente de la unión adherente por los PMN activados. En conjunto, parece probable que la elastasa derivada de los PMN desempeñe un papel en la alteración de la unión de adherencia.

Las interacciones adhesivas entre los PMN y las células endoteliales también podrían indicar a las células endoteliales que participen activamente en la migración transendotelial de los PMN separándose unos de otros, es decir, en la formación de una brecha interendotelial (Fig. 1A). Esta afirmación está respaldada por las siguientes líneas de evidencia. Los PMN adheridos pueden inducir aumentos en los niveles de Ca2+ de las células endoteliales, y la quelación de este Ca2+ produce una inhibición de la migración transendotelial de los PMN. Además, la inhibición de la miosina-cadena ligera quinasa endotelial (un determinante clave de la formación de la brecha celular interendotelial) redujo la migración transendotelial de los PMN (11). Por último, como se ha señalado anteriormente, los PMN adheridos afectan a la β-catenina intracelular antes que a la VE-cadherina de la membrana plasmática. En conjunto, estas observaciones indican que las células endoteliales pueden ser inducidas a participar activamente en la migración transendotelial de los PMN retrayéndose unas de otras.

Evidencia a favor de la diapédesis transcelular

Muchos de los primeros y más recientes informes que examinaron la diapédesis leucocitaria in vivo utilizando un enfoque ultraestructural indican que la mayoría de los PMN salen de la vasculatura transcelularmente, es decir, a través de poros o pasajes que atraviesan el citoplasma endotelial. El examen de secciones seriadas mediante microscopía electrónica de transmisión sugiere que los PMN pueden migrar a través de regiones que no están asociadas a uniones célula-célula identificables (4, 5, 8). Se ha argumentado que incluso el seccionamiento seriado no proporciona una prueba inequívoca de que una unión célula-célula no estaba cerca, sino que puede haberse pasado por alto. Además, puede ser difícil identificar las uniones adherentes densas en electrones, especialmente en aquellas regiones en las que el endotelio tiene una altura <0,5 μm. Por último, datos recientes in vitro indican que las uniones adherentes célula-célula se desmontan molecularmente durante la diapédesis de los PMN (10) y, por tanto, no se esperaría verlas morfológicamente.

Las imágenes de microscopía electrónica de barrido proporcionan pruebas más convincentes de que los PMN penetran en las células endoteliales a través de aberturas que no están asociadas a contactos célula-célula endotelial (4, 9). Los PMN que están en proceso de diapedesis parecen tener una forma de mancuerna, con una constricción en la región a nivel del endotelio (4, 5, 7, 8, 9, 13, 15). Según el grado de avance de la diapédesis, se observa una extensión en forma de burbuja que sobresale en la luz del vaso o se extiende hacia el intersticio (5, 9, 11, 15). Esto indica que los leucocitos están apretando a través de un poro circular de un diámetro pequeño y limitado, en lugar de inducir la retracción de las células endoteliales individuales entre sí. La célula endotelial y el leucocito permanecen en estrecho contacto durante la diapédesis. A menudo, el endotelio parece extenderse a lo largo del lado luminal de la superficie del PMN para engullirlo completamente, cerrando así la brecha luminal antes de que el PMN sea liberado en la matriz tisular (4, 5, 8). Este proceso se ha observado con frecuencia durante la emigración in vivo, pero no se ha demostrado que ocurra durante la migración transendotelial in vitro.

Mecanismos potenciales implicados en la diapédesis transcelular

Aunque es difícil aplicar enfoques mecanicistas estrictos en los estudios in vivo, hay suficientes pruebas circunstanciales para apoyar varios mecanismos posibles por los que los PMN emigran transcelularmente. Es concebible que los poros transcelulares a través de los cuales migran los PMN sean el resultado de daños proteolíticos en el endotelio. Sin embargo, se ha señalado que, al menos desde el punto de vista ultraestructural, el endotelio no sufre daños y sigue formando caveolas y vesículas endocíticas incluso en las regiones de la membrana que están en estrecho contacto con los PMN (13). Es más probable que los PMN, que parecen migrar durante distancias cortas a lo largo de la superficie endotelial apical, busquen regiones delgadas del endotelio, como las fenestras. Las fenestras pueden ser abiertas (50 nm de diámetro) o estar subtendidas por un diafragma del grosor de dos membranas plasmáticas (desprovistas de citoplasma). Por lo tanto, los PMN podrían atravesar fácilmente las fenestras abiertas o atravesar proteolíticamente las fenestras con diafragma sin dañar el endotelio propiamente dicho. Las fenestras pueden representar una vía importante para la emigración de PMN en aquellos órganos que contienen microvasos fenestrados (por ejemplo, la mucosa gastrointestinal o las glándulas secretoras).

En los órganos que contienen microvasos continuos (por ejemplo, la piel o el músculo), los PMN pueden utilizar caveolas o vesículas pinocitarias e insertar filopodios en ellas para penetrar la barrera endotelial. Se cree que estas estructuras, de entre 50 y 100 nm de diámetro, median en el transporte de proteínas a través del endotelio y proporcionan una ruta extrafuncional para la fuga de proteínas vasculares durante la inflamación. Recientemente, se ha demostrado que las caveolas forman orgánulos vesiculo-vacuolares, que pueden formar pequeños pasajes continuos unidos a la membrana a través del citoplasma de una célula endotelial (6). Se ha demostrado que la formación de estas caveolas y vesículas continúa en las regiones de la membrana de la superficie endotelial que están en contacto con los PMN adheridos (13). Además, los PMN que se adhieren estrechamente a la superficie de la célula endotelial a menudo extienden filopodios en forma de dedos en hendiduras de la membrana plasmática apical, remodelando así la superficie endotelial (4, 7, 8). La fuerza de protrusión de un filopodio adherido a la formación de orgánulos vesiculo-vacuolares puede conducir a la aparición de este filopodio en el lado endotelial abluminal (Fig. 1B), donde puede interactuar fácilmente con la matriz extracelular y extenderse a lo largo de ella (Fig. 1B).

Se ha demostrado una concentración de F-actina y microfilamentos en los pseudópodos líderes de los PMN durante la diapedesis in vivo (15) e in vitro (3) y puede generar la fuerza necesaria para arrastrar los procesos celulares que avanzan a través de los poros transcelulares. Los poros pueden ampliarse hasta un tamaño de 3-5 μm, a través del cual el leucocito puede atravesar fácilmente. Este ensanchamiento del poro vacuolar inicial puede llevarse a cabo en parte por las fuerzas generadas por la tensión en el sistema de microfilamentos corticales presentes en la parte esférica del leucocito que aún sobresale en el lumen del vaso. De hecho, se ha observado una concentración de F-actina en la región caudal de los PMN transmigrantes durante las últimas etapas de la diapedesis (15). Además, el reordenamiento del citoesqueleto en el citoplasma endotelial puede ayudar al ensanchamiento del poro transendotelial, como se ha sugerido previamente (14). El proceso de formación del poro iría acompañado de una extensión de las regiones apicales de la membrana endotelial a lo largo de la superficie celular de los PMN, lo que llevaría a la eventual engullición de las porciones luminales de los PMN por parte del endotelio, como se ha demostrado en las micrografías electrónicas (Fig 1B). Esta participación activa del endotelio ayudaría a un rápido resellado del revestimiento endotelial, limitando así la fuga de proteínas.

Resumen

De esta revisión de las pruebas, se desprende que los PMN pueden utilizar tanto vías paracelulares como transcelulares para atravesar la barrera endotelial durante la inflamación. Cabe señalar que la migración transendotelial de los PMN in vitro favorece la vía paracelular, mientras que la migración transendotelial de los PMN in vivo favorece la vía transcelular. Si se asume teleológicamente que el PMN transmigrante elegirá la vía de menor resistencia, entonces puede haber una explicación para la aparente discrepancia entre los resultados obtenidos utilizando enfoques in vitro e in vivo.

En las monocapas de células endoteliales cultivadas, las regiones más atenuadas se encuentran cerca de las uniones célula-célula, y por lo tanto no es sorprendente que éste sea el sitio preferido donde se produce la diapédesis. Además, en las células endoteliales cultivadas, las uniones intercelulares son estructuras inestables que se desmontan y vuelven a montar constantemente. Esta región sería fácilmente accesible para los seudópodos de los leucocitos que transmigran. También hay pruebas de que, incluso in vitro, la vía paracelular utilizada por los PMN durante la diapédesis está específicamente seleccionada, es decir, la diapédesis se produce preferentemente en las esquinas tricelulares y no entre dos células endoteliales (1). Las uniones de adherencia y las uniones estrechas son discontinuas en estas esquinas tricelulares, por lo que presentan el camino de menor resistencia para los PMN que transmigran. En cambio, las uniones interendoteliales están mucho mejor desarrolladas in vivo y son más resistentes al movimiento de proteínas a través de ellas. Por lo tanto, los PMN pueden utilizar preferentemente los poros de la región delgada de las células endoteliales, como las fenestras o las caveolas, como vía de menor resistencia.

Atribuir la vía preferente (paracelular frente a transcelular) utilizada por los PMN durante la diapédesis a si se utilizaron enfoques in vitro o in vivo para estudiar este fenómeno es, en particular, una simplificación excesiva. Hay muchos ejemplos de desviaciones de este paradigma. Por ejemplo, hay pruebas que indican que los PMN pueden utilizar la vía paracelular in vivo y la vía transcelular in vitro. Además, si la vía transcelular es la preferente para la diapédesis de los PMN in vivo, ¿por qué interferir con las proteínas de unión altera drásticamente la diapédesis de los PMN in vivo? Es muy posible que esta discusión persista durante años, al igual que la discusión sobre si el movimiento transendotelial de proteínas se produce preferentemente por la vía paracelular o transcelular. Cabe imaginar que los argumentos relativos a la vía de migración transendotelial de los PMN pueden atribuirse, en parte, a la naturaleza de la respuesta inflamatoria o a la naturaleza del lecho vascular en el que se produce. Es de esperar que nuevos estudios proporcionen información adicional que permita resolver esta controversia.