Derivatización química en bioanálisis

Aplicaciones

La derivatización química ha demostrado durante mucho tiempo ser una técnica analítica en bioanálisis para superar los problemas asociados a la baja eficacia de la ionización, la inestabilidad de los compuestos, la escasa selectividad o el rendimiento cromatográfico inaceptable (mala retención, mala forma de los picos y problemas de arrastre) e incluso la escasa volatilidad para la separación por GC . Esta técnica es una poderosa herramienta en muchas áreas de la química, como las disciplinas médica, forense, alimentaria, de control del dopaje y medioambiental. El objetivo de la derivatización química es modificar la estructura del analito (ya sea un nucleófilo o un electrófilo) utilizando un reactivo químico (ya sea un electrófilo o un nucleófilo dependiendo de la naturaleza del analito) y, como resultado, se forma un nuevo compuesto (el derivado de la reacción) con propiedades químicas y físicas mejoradas para el análisis. Las condiciones de reacción (cantidad de reactivo, tiempo y temperatura de reacción, etc.) se optimizan a favor de la formación del derivado deseado con el mayor rendimiento de reacción posible. Pueden desarrollarse procedimientos adicionales de limpieza de la muestra para eliminar los subproductos no deseados y el exceso de reactivos, minimizando así las inferencias del analito en el momento del análisis.

Usando la derivatización química, se hace posible el análisis de lo imposible. En la literatura se han presentado muchos ejemplos de esto, que afectan a la detección de GC, LC-MS/MS y NMR. Lo más notable ha sido la separación cromatográfica de enantiómeros a través de la derivatización quiral utilizando reactivos de resolución específicos sin el uso de columnas quirales especializadas y condiciones de separación.

Consideraciones

La selección del reactivo químico apropiado es esencial para una derivatización exitosa y depende de la aplicación específica. En general, si el analito objetivo es un nucleófilo (compuesto con un exceso de electrones), se selecciona un electrófilo (compuestos con deficiencia general de electrones) como reactivo, y viceversa. Los reactivos deben ser selectivos (dirigirse a un sitio específico de la molécula), evitando así la derivatización en múltiples sitios de la molécula objetivo, metabolitos o componentes endógenos. Por ejemplo, en el caso de una molécula que contenga grupos funcionales hidroxilo y amino, debe evitarse el uso de cloruros o anhídridos ácidos como reactivos de derivatización, ya que derivarán ambos grupos funcionales. Por el contrario, el uso del cloruro de dansilo como reactivo de derivatización es apropiado para los grupos funcionales amino y fenol, ya que no reacciona con los alcoholes alifáticos. Otros requisitos que deben considerarse en la selección del reactivo son la disponibilidad (comercial), la pureza y el coste. Normalmente, el coste de los reactivos es mínimo y, por lo tanto, no representa una barrera para su uso.

Usando condiciones optimizadas, los procedimientos de derivatización química suelen ser lo suficientemente robustos para ser aplicados en el bioanálisis farmacéutico, y son capaces de cumplir con las expectativas regulatorias. Esto suele demostrarse durante un riguroso proceso de validación en el que se tienen en cuenta varios parámetros, entre otros, la exactitud, la precisión, la selectividad, el efecto de la matriz, etc. La selección del estándar interno es esencial para corregir cualquier posible pérdida de analito durante los distintos pasos de la manipulación de la muestra y el bioanálisis, garantizando así la solidez del ensayo. Siempre que sea posible, debe utilizarse un patrón interno estable al deuterio o al 13C; de lo contrario, puede sustituirse por un análogo con reactividad, recuperación y propiedades cromatográficas similares. Además, es imperativo considerar y evaluar, cuando sea posible, las vías metabólicas del analito de interés; es necesario evitar la conversión de los metabolitos de vuelta a la molécula madre durante el procedimiento de derivatización, ya que estos procesos a menudo implican condiciones duras (pH, calor, largos tiempos de incubación, etc.). Desgraciadamente, esto puede complicarse por la falta de estándares de referencia para los metabolitos, y la falta de información metabólica al principio del ciclo de vida del desarrollo del fármaco debido a las estrategias de desarrollo diferencial o acelerado.

La derivatización química como forma de arte

El uso de la derivatización química ha disminuido en los últimos años a medida que las nuevas tecnologías de separación han evolucionado y se han hecho más comunes. La evolución de la cromatografía de fluidos supercríticos (SFC), por ejemplo, ha abierto una nueva vía para el análisis estereoisomérico quiral; reduciendo así la necesidad de derivatización quiral en ciertos casos . Las generaciones más sensibles de instrumentos de espectrometría de masas de triple cuadrupolo con tecnologías de ionización novedosas o mejoradas están llevando los límites de detección a niveles bajos de picogramos, y como resultado la demanda de derivatización química para mejorar la sensibilidad del ensayo (a través de la mejora de la ionización o la selectividad) han disminuido. Otras tecnologías, como la UHPLC, la micro/nano-LC (para mejorar la eficacia de la ionización) y los instrumentos TOF con capacidad de movilidad iónica (separación electrónica, en lugar de química/física) también han contribuido a la disminución de la derivación química en el laboratorio bioanalítico. Dicho esto, sin embargo, la técnica se sigue aplicando para separaciones muy complejas en las que las tecnologías mencionadas no pueden tener un impacto adecuado. A veces, el acoplamiento de la derivatización química con una de estas tecnologías tiene un impacto mejorado/adicional. En particular, la combinación de la SFC con la derivatización quiral ha demostrado ser superior para la separación quiral en comparación con el análisis de la SFC (datos no mostrados).

Debido a este declive de la técnica y a su complejidad en comparación con otras técnicas analíticas, la derivatización química ha evolucionado hasta convertirse en una «forma de arte» especializada en el laboratorio, que requiere habilidades especializadas combinadas con un gran dominio de la química. Como consecuencia, cada vez son menos los científicos en entornos de DMPK que consiguen dominar la técnica y llegar a ser competentes en su aplicación. La cuestión es entonces cómo preservar estas habilidades y transmitirlas a las futuras generaciones de científicos analíticos. Se espera que números especiales como éste, artículos de revisión, capítulos de libros, guías que contengan protocolos experimentales faciliten y promuevan el uso de la derivatización química como gran herramienta analítica.

Resumen

Este número temático cubre los avances en las técnicas de derivatización existentes utilizadas en la investigación bioanalítica, así como nuevos métodos y enfoques innovadores (por ejemplo, combinación de derivatización con LC-MS de microflujo y la idea de nuevas técnicas de etiquetado químico de Niwa et al. ).

El número pretende cubrir aspectos relacionados con:

• Métodos de derivatización en bioanálisis LC-MS (incluyendo HPLC);

• Derivatización de péptidos para el análisis de proteínas terapéuticas;

• Reactivos de derivatización quirales aplicados a muestras biológicas (véase Vashistha et al. );

• Derivatización para el análisis de compuestos endógenos (véase ‘Beyond Classical Derivatization: Analyte ‘derivatives’ in the bioanalysis of endogenous and exogenous compounds’ by Barnaby et al. , o ‘Derivatization of steroids in biological samples for GC-MS and LC-MS analyses’ by Marcos et al. );

• Procedimientos de derivatización en el control del dopaje humano (véase la interesante revisión de Athanasiadou et al. ).

Si bien es cierto que la derivatización química es una herramienta más en la caja de herramientas bioanalíticas, es un «must have» para un laboratorio DMPK y que seguirá teniendo un impacto abordando muchos desafíos bioanalíticos.

Por lo tanto, si no te gusta tu analito, ¡cámbialo (con derivatización química)!