Degradación asociada al retículo endoplásmico (ERAD)

2.1 Proceso de plegado de proteínas y reconocimiento de proteínas mal plegadas

Alrededor del 30% del total de proteínas y de todas las proteínas transmembrana de la célula se sintetizan en el RE, que actúa como portal de entrada a la vía secretora a través del canal Sec61 . Al ser translocada, la secuencia de señal hidrofóbica terminal N de la proteína recién sintetizada es escindida por un complejo de peptidasas . Las modificaciones co- y post-traduccionales, como la formación de enlaces disulfuro, los pasos iniciales de la N-glicosilación y el anclaje del glicofosfatidilinositol (GPI) tienen lugar en el RE.

El entorno oxidante del RE ayuda a la formación de enlaces disulfuro, lo que estabiliza la estructura terciaria de la proteína y facilita su ensamblaje. Durante el proceso de plegado, los enlaces disulfuro se forman a través de la oxidación de pares de tioles libres en residuos de cisteína por parte de las isomerasas de disulfuro de proteínas (PDI). Las PDIs actúan como ciclos, y después de la oxidación inicial, los enlaces disulfuro son a veces isomerizados por PDI y ERp57, que es una tiol oxidoreductasa, con el fin de estabilizar el correcto plegamiento de la proteína . Por el contrario, la reducción de los enlaces disulfuro de las proteínas mal plegadas es necesaria para el paso de retrotranslocación de la ERAD. De hecho, la PDI permite la retrotranslocación del virus simio-40 (SV-40) y de la toxina del cólera. La ERdj5, una oxidorreductasa del RE, reduce los enlaces disulfuro e interactúa con la EDEM (proteína similar a la mannosidasa que mejora la degradación del RE) y también acelera el paso de retrotranslocación del SV-40 . ERDJ5 también regula la degradación de la variante de la α1-antitripsina causante de la enfermedad (Hong Kong nulo).

El plegado se ve favorecido por las chaperonas moleculares que guían contra el mal plegado y el despliegue. Los glicanos tipo chaperona se unen a los N-glicanos desempeñando un papel crucial en el plegamiento y la degradación de las proteínas. Es evidente que la N-glicosilación, el control de calidad del plegado de las proteínas y la ERAD están funcionalmente vinculados. Después de entrar en el RE, una gran mayoría de la cadena polipeptídica recién sintetizada está siendo glicosilada por el N. La enzima oligosacariltransferasa reconoce la secuencia consenso Asn-X-Ser/Thr en la mayor parte de la molécula de proteína naciente e integra covalentemente un grupo glicano central con alto contenido en manosa (Glc3Man9GlcNAc2) procedente del dolicol localizado en la membrana del RE a la proteína. Debido a la corta vida media de la forma triglicosilada del oligosacárido unido a la proteína, el procesamiento del glicano comienza inmediatamente después de la transferencia de los grupos glicanos precursores a través de las enzimas glucosidasas. Tras el corte de dos o tres residuos de glucosa, la proteína naciente puede interactuar con lectinas de control de calidad como CNX y CLR. Esta interacción se mantiene hasta la escisión del residuo de glucosa restante. Después de liberar la glicoproteína del ciclo CNX/CLR, la glucosa final también se recorta creando un sustrato no glicosilado. Esto compromete la interacción del sustrato con las lectinas chaperonas. En esta etapa, si la proteína está correctamente plegada, podría salir del RE para su destino final. Sin embargo, si la glicoproteína todavía está desplegada, es retenida en el RE y reglucosilada por la UDP-glucosa:glicoproteína glucosiltransferasa y rebota con la CNX y la CLR dando a la proteína más tiempo para su correcto plegado. Todavía no se conocen los mecanismos implicados en la terminación de los ciclos de reglicosilación/deglicosilación. Sin embargo, está claro que, si la cadena polipeptídica no puede alcanzar su forma madura tras repetidos intentos de plegado, los residuos de manosa terminales de la cadena de glicanos del núcleo son eliminados gradualmente por la α1,2-manosidasa I del RE (ERMan1). ERMan1 produce el isómero Man8GlcNAc2 eliminando un residuo de manosa de la rama media de los N-glicanos. Mediante este recorte, la glicoproteína se convierte en sustratos más pobres para la reglicosilación y la salida del ciclo CNX.

Los parches hidrofóbicos de las proteínas correctamente plegadas suelen estar enterrados en el interior de las proteínas solubles. Sin embargo, esos parches podrían estar expuestos en las proteínas mal plegadas. Si una proteína tiene superficies hidrofóbicas expuestas, BiP se une a ella para ocultar estas superficies propensas a la agregación para los intentos de plegado adecuados, evitando la agregación. Sin embargo, si el plegado no tiene éxito o se retrasa, la interacción prolongada entre la chaperona y la proteína mal plegada sirve para un proceso sofisticado en el que la proteína se transfiere a otras chaperonas y/o al proceso ERAD.

Es bien aceptado que el primer paso de ERAD es la selección de las proteínas mal plegadas por parte de las chaperonas. Ya en 1999 se descubrió que los sustratos de la ERAD de la levadura diferían notablemente en su requerimiento de la Hsp70 luminal del RE, BiP . La degradación de sustratos solubles como pαF y una forma mutante de la proteasa vacuolar carboxipeptidasa Y* (CPY*) dependían de BiP, mientras que la degradación de las proteínas transmembrana Pdr5*p, Ste6-166p, Sec61-2p y Hmg2p se producía de forma independiente de BiP. En 2004, se demostró que los sustratos con dominio citosólico como Ste6-166p se degradaban de forma independiente de BiP, mientras que las proteínas con defectos luminales requerían BiP, lo que sugiere que dependiendo de la topología de la lesión mal plegada (lumen del RE, membrana del RE y citoplasma) las chaperonas citosólicas o luminales funcionan en el reconocimiento y la orientación para la degradación.

Es posible estudiar el reconocimiento del sustrato durante la ERAD utilizando proteínas mal plegadas modelo. Está claro que la desmanosilación es necesaria para la degradación de las glicoproteínas mal plegadas ya que la inhibición de este recorte de manosa estabiliza las glicoproteínas mal plegadas en el RE . La sobreexpresión de ERMan1 acelera la degradación de las proteínas N-glicosiladas. La glicoproteína resultante que contiene Man8-GlcNAc2 después de este recorte se convierte en un sustrato para EDEM1 (ER-degradation enhancing mannosidase-like protein 1, Htm1p en la levadura) – una lectina relacionada con la mannosidasa en el RE. Se propuso además que las glicoproteínas mal plegadas interactúan con ERManI y EDEM1 para su ERAD, y la interacción lectina-carbohidrato resultó ser crucial para el reconocimiento del sustrato de EDEM . Aunque se sugirió que ERMan1 era un temporizador biológico que iniciaba la ERAD de las proteínas mal plegadas, estudios recientes revelaron que las mannosidasas no son las únicas responsables de la desmanosilación intensiva durante la ERAD, especialmente en condiciones no basales. En condiciones de estrés de ER (respuesta de proteína no plegada activa), la elevación transcripcional de EDEM1 mejora la eficiencia de ERAD suprimiendo la desmanosilación proteolítica de ERMan1 . Parece que las EDEM también desempeñan un papel importante en la desmanosilación de sustratos . EDEM1 también impide la reglicosilación y promueve la retrotranslocación y la degradación de algunos sustratos de la ERAD . Por otra parte, mientras que el dominio de homología de la mannosidasa (MHD) de Htm1p es necesario para la unión de sustratos, la EDEM1 de mamíferos se une a proteínas mal plegadas independientemente del dominio MHD, y por lo tanto, la unión de sustratos de EDEM1 puede no requerir el recorte de manosa o incluso la glicosilación . Así pues, además de los restos de oligosacáridos ligados al N de las glicoproteínas, EDEM1 puede reconocer las lesiones de plegado de las proteínas mal plegadas. En resumen, los EDEMs están directa o indirectamente implicados en la desmanosilación de las glicoproteínas y/o sirven como receptores que se unen y dirigen a las proteínas recortadas en manosa para la ERAD (Figura 1).

El truncamiento de la manosa terminal de la rama C expone residuos de manosa α terminales α1,6 enlazados que funcionan como señal de reconocimiento para las lectinas de la ERAD, como OS9 (Yos9 en levadura) y XTP3-B (Figura 2). A través de su dominio de homología del receptor de manosa-6-fosfato (MRH), ambas proteínas reconocen principalmente la α1,6-ligada a la manosa j. Además, OS-9 también reconoce la α1,6-ligada a la manosa e y c .

Varios informes sugieren que los factores (EDEMs, OS9 y XTP3-B) necesarios para el reconocimiento y la orientación de sustratos residen en complejos supramoleculares y/o interactúan con importantes reguladores de la ERAD . Por ejemplo, EDEM1 interactúa con CNX, recibe sustratos del ciclo de CNX y facilita la degradación de sustratos de ERAD como el mutante NHK-α1-antitripsina . EDEM1 también se asocia con los componentes de la maquinaria de retrotranslocación del RE. Se sugiere que EDEM1 se une a proteínas mal plegadas y utiliza su dominio MHD para dirigir las proteínas aberrantes a la proteína SEL1L, glicoproteína residente en el RE, del complejo ubiquitina ligasa Hrd1-SEL1L . SEL1L andamiaje varios factores de reconocimiento de sustrato luminal y los une a Hrd1. OS9 y XTP3-B también se asocian con el complejo Hrd1-SEL1L, que también incluye BiP y GRP94 . Además, se propone que XTP3-B vincule a BiP con el complejo Hrd1 . Según una hipótesis, estas tres chaperonas (EDEM1, OS9 y XTP3-B) funcionan como oligómeros, donde un monómero interactúa con el sustrato y otro con el complejo Hrd1-SEL1L . Además, EDEM1 también interactúa con Derlins, una proteína transmembrana, que es candidata a translocon; además, se ha demostrado que Derlin2 potencia la interacción de EDEM1 con una AAA-ATPasa citosólica p97, que acopla la hidrólisis de ATP a la retrotranslocación de las proteínas mal plegadas.

Está claro que el paso de reconocimiento de sustrato de la ERAD es un mecanismo complicado, en el que participan varias enzimas y chaperonas diferentes que tienen papeles distintos pero concertados en la ERAD. Además, dependiendo de los sustratos, el número y las características de las proteínas implicadas varían. Por ejemplo, se han sugerido funciones concertadas de EDEM, ERdj5 y BiP en la degradación de proteínas mal plegadas. Tras salir del ciclo CNX-CLR, EDEM1 recorta aún más la estructura del glicano Man8-GlcNAc2 y ERdj5 reduce los enlaces disulfato. Al mismo tiempo, ERdj5 activa la actividad ATPasa de BiP. La BiP unida al ADP se une a la proteína mal plegada y la mantiene en forma de componente de retrotranslocación hasta que se transfiere al complejo de retrotranslocación.

El ERdj5 también participa en el control de calidad de las proteínas no glicosiladas, que es independiente de las proteínas tipo lectina. La cadena ligera de inmunoglobulina (Ig-K-LC), un sustrato ERAD no glicosilado, se degrada de forma dependiente de BiP. Okuda-Shimizu y Hendershot han caracterizado una vía ERAD para este sustrato BiP no glicosilado y diferentes dinámicas de interacción de proteínas que se ha visto que juegan un papel en este proceso. La Ig-K-LC tiene dos enlaces disulfuro intramoleculares, y su forma totalmente oxidada no tiene capacidad para pasar del RE al citoplasma. La BiP interactúa sólo con la forma parcialmente oxidada de la Ig, impidiendo la oxidación completa de la Ig-K-LC y facilitando así su liberación del RE . Además, una proteína transmembrana que contiene un dominio UBL, la proteína homoCys-residente en el RE (HERP), ha sido implicada como receptor de sustratos BiP no glicosilados . HERP interactúa con Derlin1, y la Ig-K-LC parcialmente oxidada se transfiere de BiP al complejo HERP-Derlin1-Hrd1 y posteriormente se dirige a la degradación proteasomal . Además de BiP, ERdj5, como disulfuro reductasa, también se indica que es importante para la ERAD de las proteínas no glicosiladas . Los sustratos no glicosilados capturados por BiP son transferidos a ERdj5 para la ruptura de los enlaces disulfuro. A continuación, estos sustratos son transferidos a SEL1L con la ayuda de BiP para su retrotranslocación . Además de BiP, tanto OS9 como XTP3-B han sido implicados en la ERAD de proteínas no glicosiladas.