Cromatografía de filtración en gel

Aplicaciones de la cromatografía de filtración en gel

La cromatografía de filtración en gel, un tipo de cromatografía de exclusión por tamaño, puede utilizarse para fraccionar las moléculas y los complejos de una muestra en fracciones con un rango de tamaño determinado, para eliminar de la muestra todas las moléculas de tamaño superior a un tamaño determinado, o una combinación de ambas operaciones. La cromatografía de filtración en gel puede utilizarse para separar compuestos como pequeñas moléculas, proteínas, complejos proteicos, polisacáridos y ácidos nucleicos cuando están en solución acuosa. Cuando se utiliza un disolvente orgánico como fase móvil, el proceso se denomina en cambio cromatografía de permeación en gel.

La cromatografía de filtración en gel también puede utilizarse para:

• Fraccionamiento de moléculas y complejos dentro de un rango de tamaño predeterminado
• Análisis y determinación del tamaño
• Remoción de grandes proteínas y complejos
• Intercambio de tampones
• Desalación
• Remoción de pequeñas moléculas como nucleótidos, cebadores, colorantes, y contaminantes
• Evaluación de la pureza de la muestra
• Separación de radioisótopos ligados de los no ligados

Los medios de cromatografía por filtración de gel para todos los usos anteriores están disponibles en columnas de flujo por gravedad preenvasadas, columnas de centrifugado, columnas de cromatografía de baja y media presión y resinas embotelladas.

Mecanismo de la cromatografía de filtración en gel

En una columna de cromatografía de filtración en gel, la fase estacionaria está compuesta por una matriz porosa, y la fase móvil es el tampón que fluye entre las perlas de la matriz. Las perlas tienen un rango de tamaño de poro definido, conocido como rango de fraccionamiento. Las moléculas y los complejos que son demasiado grandes para entrar en los poros permanecen en la fase móvil y se mueven a través de la columna con el flujo del tampón. Las moléculas y complejos más pequeños que pueden entrar en los poros entran en la fase estacionaria y se mueven a través de la columna de filtración de gel por un camino más largo a través de los poros de las perlas.

Cualquier molécula o complejo que esté por encima del rango de fraccionamiento para una columna de cromatografía de filtración de gel particular se moverá a través de la columna más rápido que cualquier molécula que pueda entrar en la fase estacionaria. Por lo tanto, cualquier constituyente de la muestra que esté por encima del rango de fraccionamiento eluirá primero (en el volumen vacío) antes que cualquier cosa que esté en el rango de fraccionamiento. El tamaño mínimo que permanecerá en la fase móvil y no entrará en la fase estacionaria se conoce como límite de exclusión. Bio-Rad ofrece medios y columnas de cromatografía de filtración en gel con límites de exclusión que varían en tres órdenes de magnitud, desde 100 daltons hasta 100.000 daltons (100 kDa).

Las moléculas y complejos que pueden entrar en la fase estacionaria se fraccionarán en función de sus tamaños. Las moléculas más pequeñas migrarán profundamente en los poros y se retrasarán más que las moléculas más grandes, que no entran tan fácilmente en los poros y, por tanto, se eluyen de la columna más rápidamente. Esta diferencia en la migración de los poros conduce al fraccionamiento de los componentes por tamaño, con la elusión de los más grandes primero.

En las columnas de cromatografía de filtración en gel diseñadas para la desalación, el intercambio de tampones y la eliminación de moléculas pequeñas, como los nucleótidos, las sales y los compuestos pequeños entran fácilmente en los poros, se retrasan y migran más lentamente a través de la columna que las proteínas o los ácidos nucleicos más grandes. Por lo tanto, los componentes de interés de la muestra se eluyen antes que las sales, los nucleótidos, etc. Los kits de limpieza de ADN que utilizan este mecanismo suelen contener columnas de filtración en gel.

La resolución, definida aquí como la nitidez de los límites entre las fracciones de tamaño, viene determinada por el tamaño de las microesferas y por una serie de otros factores. Un tamaño de grano más pequeño generalmente produce una mayor resolución en una columna de cromatografía de filtración de gel. Las moléculas compactas se difunden a través de la fase estacionaria más rápidamente que las moléculas lineales. La exclusión por tamaño, el rango de fraccionamiento y la velocidad de elución se ven afectados por la composición del tampón, la fuerza iónica y el pH. Para el fraccionamiento de mezclas complejas de proteínas, puede ser necesario determinar empíricamente los tiempos de elución y los límites de exclusión por tamaño.

Medios de cromatografía de filtración en gel

Un criterio importante para los medios de cromatografía de filtración en gel es que los medios sean inertes y que nada en la muestra o cualquier tampón se una a los medios. Otra consideración es el tipo de columna de filtración de gel que se utiliza y si se usa en un sistema de cromatografía presurizado o en columnas de flujo por gravedad o de centrifugado. Si se utiliza un sistema de cromatografía presurizado, tanto la columna como el medio deben ser capaces de tolerar la presión y los caudales utilizados.

Los medios comúnmente utilizados para la cromatografía de filtración en gel se basan en perlas de agarosa o poliacrilamida, dextrosa para sistemas de gravedad o baja presión, y resinas poliméricas para sistemas de presión media. La elección del medio depende de las propiedades de los componentes a separar y de otros factores experimentales. Las siguientes son consideraciones generales a la hora de determinar la elección del medio de cromatografía de filtración en gel:

• Gama de fraccionamiento
• Límite de exclusión de tamaño
• Presión de operación
• Tasa de flujo
• Viscosidad de la muestra
• Gama de pH
• Autoclavabilidad
• Tolerancia a disolventes orgánicos miscibles en agua; algunas muestras pueden ser más solubles en una mezcla orgánica con agua
• Tolerancia a los detergentes, agentes caotrópicos, formamida, etc.
• Temperatura de operación

Los tipos de muestras, la elección de los medios y la configuración del sistema de cromatografía determinarán qué parámetros son los más importantes para una aplicación de purificación determinada.