ChIP off the old block: Más allá de la inmunoprecipitación de la cromatina

A partir de un método clásico -la inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP)- se están desarrollando numerosas técnicas para evaluar qué se une al ADN y dónde. Las técnicas emergentes reducen el tamaño de las muestras, interrogan a los complejos proteicos unidos al ADN o evalúan con más detalle los nucleótidos implicados. Todos estos enfoques pretenden superar las antiguas limitaciones de la ChIP y ampliar las preguntas que los científicos pueden plantear sobre la regulación de los genes, el desarrollo y las enfermedades.

La inmunoprecipitación con cromatina, una de las técnicas más utilizadas en biología molecular, se inventó hace más de 30 años, y algunas cosas han cambiado, mientras que otras han permanecido igual.

El protocolo básico sigue siendo similar a uno desarrollado en la década de 1980, que consiste en entrecruzar las proteínas con el ADN con formaldehído y luego fragmentar el ADN. Una proteína que interactúa con el ADN se inmunoprecipita utilizando un anticuerpo, los enlaces cruzados se invierten con calor y se analiza el ADN asociado. Posteriormente, los investigadores vincularon la técnica a la secuenciación profunda, desarrollando la técnica ChIP-seq para sondear las interacciones proteína-ADN a escala genómica.

La ChIP se ha utilizado para estudiar el funcionamiento de los factores de transcripción, la forma en que las histonas modulan la expresión génica y otras cuestiones básicas con implicaciones para el desarrollo biológico y las enfermedades. En septiembre, C. David Allis y Michael Grunstein ganaron el prestigioso premio Lasker por su trabajo sobre las histonas, una investigación basada en la ChIP. Y la ChIP-seq es ahora una piedra angular del proyecto ENCODE (ENCyclopedia Of DNA Elements), un esfuerzo por cartografiar las regiones reguladoras del genoma en varios tipos de células.

Los biólogos de la cromatina también están desarrollando una serie de tecnologías derivadas o paralelas para ir más allá de lo que ofrecen el ChIP y el ChIP-seq: para examinar complejos de proteínas, para evaluar con mayor precisión los nucleótidos exactos a los que se une un factor, para observar pequeños grupos de células y para comenzar, tentativamente, a evaluar las interacciones proteína-ADN a nivel de una sola célula.

Todas estas técnicas pretenden hacer cosas que la ChIP-seq por sí sola no puede hacer, o lo hace con lentitud. Y todas ellas tienen el mismo objetivo básico: averiguar qué moléculas están asociadas al ADN y dónde.

«Realmente no entendemos los principios fundamentales por los que las secuencias funcionales reguladoras de nuestro genoma determinan dónde y cuándo se activan los genes», dice Bradley Bernstein, director del Programa de Epigenómica del Instituto Broad en Cambridge, Massachusetts. Añade que la ChIP es «limitada en muchos aspectos. Y por eso hay estos esfuerzos para tratar de innovar nuevos enfoques o adaptar la tecnología de nuevas maneras»

«Tenemos que llegar a formas precisas y deterministas de evaluar directamente las interacciones de una sola molécula de forma sistemática en células individuales».

Haciendo que funcione

«Llamar a un arte oscuro es demasiado», dice Nir Friedman, profesor de informática y biología de la Universidad Hebrea de Jerusalén (Israel). Pero a pesar de ser una técnica de uso común, «muy poca gente tiene la paciencia suficiente para calibrar sus experimentos», afirma.

Los experimentos de ChIP-seq generan mucho ruido, señala Friedman. El formaldehído puede entrecruzar moléculas no implicadas, los anticuerpos pueden arrastrar proteínas no objetivo y la sonicación -la forma más común de romper el ADN- tiende a romper el ADN que está en una conformación abierta. Según Friedman, «puede ocurrir que más de la mitad de lo que se acaba secuenciando o mirando sea una unión no específica».

ENCODE publica directrices para evaluar la calidad de los anticuerpos y filtrar los datos sin sentido, señala Friedman. El proyecto también proporciona acceso a herramientas computacionales recientes que se utilizan, por ejemplo, para normalizar los datos con respecto a los controles e identificar «picos» o regiones de posible unión al ADN.

Elegir el anticuerpo adecuado, en particular, puede ser un reto, señala Michael-Christopher Keogh, director científico de EpiCypher, una empresa de epigenómica en Research Triangle Park, Durham, Carolina del Norte. Keogh ha participado en un estudio reciente en el que se demuestra que muchos anticuerpos populares para la investigación de las histonas no funcionan bien en la ChIP, por ejemplo, porque se unen a epítopos fuera del objetivo. El estudio también propone pasos de validación más allá de las directrices de ENCODE.

Algunos investigadores evitan el problema de los anticuerpos mediante la ingeniería de una etiqueta epitópica en su objetivo, como con CETCh-seq (CRISPR epitope tagging ChIP-seq). Una técnica de larga data, DamID (identificación de ADN adenina metiltransferasa), implica la ingeniería de factores para etiquetar el ADN vecino con marcas moleculares.

Otros investigadores siguen mejorando la técnica básica de ChIP, como el grupo de Alon Goren, del Departamento de Medicina de la Universidad de California en San Diego, que ha automatizado totalmente la ChIP-seq. Goren afirma que la concentración óptima de anticuerpos puede variar sustancialmente entre anticuerpos y tipos de células, y que algunos pasos, como la reticulación inversa, son innecesarios. El laboratorio Goren también ha demostrado que los anticuerpos monoclonales tienen ventaja sobre los policlonales.

Pero incluso cuando está totalmente optimizado, ChIP-seq sigue siendo fundamentalmente limitado. Por ejemplo, generalmente requiere 100.000 o más células para evaluar los factores de transcripción y 10.000 o más para evaluar las proteínas histónicas, dice Goren. Y en la mayoría de los casos, el método está orientado a observar una proteína, un anticuerpo a la vez.

Dice Goren: «Una vez que seamos capaces de cambiar el punto de vista de pensar en las proteínas a pensar en los complejos, obtendremos una comprensión mucho mejor de cómo funciona la biología y de lo que ocurre en las enfermedades.»

Conseguir un control de los complejos de proteínas

Un enfoque para examinar los complejos es combinar ChIP-seq con la espectrometría de masas (MS), utilizando métodos como RIME (espectrometría de masas de inmunoprecipitación rápida de proteínas endógenas) y ChIP-MS.

Sin embargo, uno de los inconvenientes de estos métodos es que las proteínas que no están asociadas al ADN también pueden ser arrastradas por la inmunoprecipitación, afirma David Steger, biólogo molecular de la Universidad de Pensilvania, en Filadelfia. En cambio, dice Steger, «lo que todo el mundo está intentando desarrollar es la proteómica específica de un locus en un potenciador concreto».

Una técnica emergente para evaluar los complejos unidos a la cromatina es la ChIP-SICAP (aislamiento selectivo de proteínas asociadas a la cromatina), desarrollada por el equipo de Jeroen Krijgsveld en el Centro Alemán de Investigación del Cáncer de Heidelberg (Alemania) y sus colegas. La técnica consiste en marcar el ADN unido a anticuerpos con biotina, que luego se retira con perlas de estreptavidina de unión a biotina antes de la especulación de masas.

Steger está aplicando ChIP-SICAP para examinar las proteínas unidas a los potenciadores que impulsan la transición de las células madre mesenquimales a adipocitos. Dice Steger: «Lo que tratamos de hacer es identificar un proteoma potenciador».

Otros enfoques aprovechan el sistema de edición de genes que implica a Cas9, que reconoce los ARN guía dirigidos a secuencias específicas de ADN. Los investigadores han marcado a Cas9 con biotina o con una enzima que promueve el etiquetado con biotina de las proteínas cercanas, que se analizan mediante EM. Este método también se ha utilizado para revelar las interacciones entre elementos genómicos distantes. Estos métodos podrían ampliar potencialmente el repertorio de métodos relacionados con ChIP-seq que pueden evaluar la arquitectura 3D del genoma, como Hi-C, ChIA-PET (Chromatin Interaction Analysis by Paired-End Tag sequencing) y HiChIP, y métodos más recientes como SPRITE (Split-Pool Recognition of Interactions by Tag Extension).

Estos métodos emergentes para evaluar los complejos unidos al ADN prometen mejorar la visión de los biólogos sobre la regulación de los genes. Sin embargo, cuando se aplican a la EM, se enfrentan a la limitación de que la EM no detecta fácilmente las proteínas de baja abundancia, señala Steger. Además, no todas las técnicas nuevas son accesibles para los no expertos.

Varias empresas ofrecen servicios de subcontratación de técnicas más establecidas, como RIME o ChIP-seq. Entre las empresas que ofrecen ChiP-seq y servicios relacionados se encuentran Active Motif, en Carlsbad (California); Diagenode, en Lieja (Bélgica) y Denville (Nueva Jersey); y Novogene, con sede en Pekín. Estas y otras empresas también ofrecen kits y componentes de ChIP-seq, aunque muchos laboratorios generan sus propios reactivos. Keogh también señala que la investigación interna puede suponer un mayor control de los pasos de optimización.

El cuidado de los parámetros experimentales durante los experimentos de ChIP puede aumentar por sí mismo la calidad de los datos, afirma Cigall Kadoch, cuyo grupo estudia varios complejos proteicos macromoleculares de gran tamaño en el Instituto Oncológico Dana-Farber y la Escuela de Medicina de Harvard en Boston, Massachusetts.

Kadoch tiene cuidado de optimizar la concentración de formaldehído utilizada para reticular las proteínas entre sí y el ADN, para cada anticuerpo y tipo de célula. A la hora de elegir los anticuerpos, toma nota de si se prevé que el epítopo sea accesible en la superficie y, por tanto, susceptible de inmunoprecipitación. Y para ver la huella de ADN de un complejo completamente ensamblado, aconseja elegir un anticuerpo contra una proteína que se añada al final del proceso de ensamblaje. «Estas son las cosas que hacen o rompen un proyecto», dice Kadoch.

Poniendo a cero la unión de factores

Otra técnica que utiliza Steger es la ChIP-exo (ChIP exonucleasa). La utiliza para identificar -con una resolución de pares de bases- dónde se unen varios factores al genoma.

Esta técnica comienza con la fragmentación del ADN por sonicación. Una exonucleasa mastica el ADN (en la dirección 5′-3′) hasta el borde donde el ADN está unido por el formaldehído a su proteína ligada. Este enfoque da como resultado una «huella» de ADN nítida para los factores unidos, que puede ser más exacta que los motivos inferidos generados computacionalmente usando ChIP-seq.

«Siempre empezamos con ChIP-seq, y a medida que nuestras preguntas evolucionan, pasamos a ChIP-exo», dice Steger, que ha utilizado la técnica para evaluar la unión del receptor de glucocorticoides al ADN. El receptor se une como un dímero a dos secuencias cortas de ADN contiguas. Steger pudo resolver la unión de un monómero, lo que no pudo hacer con ChIP-seq.

El equipo de Frank Pugh, profesor de bioquímica y biología molecular de la Universidad Estatal de Pensilvania en University Park, simplificó recientemente su método ChIP-exo y lo adaptó a la plataforma de secuenciación Illumina de uso común. Del mismo modo, Julia Zeitlinger, investigadora asociada del Instituto Stowers de Investigación Médica de Kansas City (Missouri), y sus colegas, han publicado una técnica relacionada, ChIP-nexus. Ambos desarrollos son «prometedores», afirma Michael Snyder, catedrático de genética y director del Centro de Genómica y Medicina Personalizada de la Universidad de Stanford, en California.

Por lo tanto, es necesario reducir y profundizar

Los investigadores han podido reducir el número de células necesarias para la técnica ChIP-seq ajustando los parámetros experimentales, por ejemplo, utilizando un anticuerpo de alta calidad, afirma Friedman.

Algunas técnicas, incluida una desarrollada por Friedman, utilizan adaptadores de secuenciación con código de barras, lo que permite reducir el tamaño de la muestra. Y una nueva técnica denominada «ChIPmentación» reduce los pasos necesarios para crear bibliotecas de secuenciación.

Un método que se está abriendo paso en los nuevos laboratorios es CUT&RUN (Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease), desarrollado por Steve Henikoff y sus colegas del Centro de Investigación del Cáncer Fred Hutchinson en Seattle, Washington. Este método prescinde de la reticulación mediante formaldehído y del cizallamiento del ADN mediante sonicación. En su lugar, un anticuerpo contra la diana se une a la nucleasa micrococal (MNasa), que es activada por el calcio para escindir el ADN a ambos lados de la diana. Los fragmentos de ADN resultantes se secuencian.

«Se obtiene una gran reducción de la relación señal-ruido» en comparación con la ChIP-seq, afirma John Stamatoyannopoulos, director del Instituto Altius de Ciencias Biomédicas de Seattle. Esto se debe en parte al corte limpio del ADN por parte de la nucleasa, con bajos niveles de corte fuera del sitio. Como resultado, CUT&RUN suele requerir menos lecturas de secuenciación de ADN que ChIPseq -lo que reduce los costes- y puede aplicarse a un número mucho menor de células. El equipo de Henikoff aplicó recientemente la técnica a 1.000 células para un factor de transcripción y a 100 células para una modificación de las histonas. Stamatoyannopoulos dice que el método ha suplantado en gran medida a ChIP-seq en sus laboratorios.

CUT&RUN también tiene ventajas más allá del bajo número de células. Stuart Orkin, biólogo molecular y profesor de la Universidad de Harvard, destaca la técnica por su resolución «esencialmente a nivel de nucleótidos». Con pequeños ajustes en las herramientas informáticas, su grupo pudo diferenciar los sitios de unión estrechamente espaciados de un factor de transcripción implicado en el control de la expresión de la hemoglobina fetal. Antes de obtener este resultado, no pudo inmunoprecipitar el factor de transcripción con una ChIP convencional, posiblemente porque la reticulación con formaldehído ocultaba los epítopos. CUT&RUN «funcionó a la primera», afirma.

El laboratorio de Henikoff ha adaptado la técnica para evaluar las interacciones de ADN de largo alcance y en 3D, y para realizar la inmunoprecipitación de los fragmentos escindidos utilizando un segundo anticuerpo. El grupo interrogó dos características moleculares en el mismo complejo de proteínas, un enfoque que podría ayudar a resolver cuestiones como qué combinaciones de marcas de histonas se asocian con diversos estados de los genes.

Trabajando a nivel de célula única

Para muchos biólogos moleculares, incluidos los investigadores de la cromatina, la célula única es la última frontera.

«Tenemos que dar con formas precisas y deterministas de evaluar directamente las interacciones de una sola molécula de forma sistemática en células individuales», dice Bernstein. «Es un objetivo a largo plazo». Los datos de las células individuales podrían rastrear potencialmente los factores de unión al ADN cuando las células salen del estado de célula madre durante el desarrollo, o en tumores con altos niveles de heterogeneidad celular.

Varios enfoques se están acercando a este objetivo. Sin embargo, «muchos de los métodos unicelulares tienen una sensibilidad limitada», afirma Christopher Benner, biólogo del genoma de la Universidad de California en San Diego. Bernstein y sus colegas, por ejemplo, generaron datos de ChIPseq unicelulares utilizando un sistema de microfluidos y un código de barras. De cada célula, la técnica capturó entre 500 y 10.000 «lecturas» únicas, que representan un evento de unión al ADN, en contraste con los millones de lecturas capturadas con poblaciones de células.

Varios métodos también pueden aportar datos sobre las regiones activas del genoma. ATAC-seq (Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing) despliega una transposasa hiperactiva que se integra en el genoma en regiones de cromatina abierta e introduce adaptadores de secuenciación. ATAC-seq puede adaptarse a células individuales y los datos de la secuencia resultante pueden ser interrogados con una variedad de enfoques computacionales. Estos enfoques pueden, por ejemplo, identificar secuencias promotoras o identificar patrones en experimentos que eliminan simultáneamente elementos de control del ADN o evalúan la expresión del ARN.

ATAC-seq tiene inconvenientes, como la integración incompleta en regiones accesibles, señala Snyder. Pero la técnica puede ser poderosa: puede desplegarse para insertar y obtener imágenes de fluoróforos, lo que da lugar a datos de imágenes sobre la organización genómica en 3D antes de la secuenciación, señala Snyder.

Snyder señala los trabajos de imagen de laboratorios como el de Alistair Boettiger en Stanford, que está desarrollando formas de obtener imágenes simultáneas de elementos genéticos y transcripciones de ARN nacientes con imágenes de superresolución, para evaluar qué elementos promueven o anulan la expresión de los genes. «Las imágenes son el futuro», añade Stamatoyannopoulos. Otros investigadores señalan que, a medida que mejore la secuenciación por nanoporos de «tercera generación», se desarrollarán métodos similares al ChIP para conectarse a ella.

«Puede que necesitemos formas totalmente ortogonales de hacer esto», dice Bern-stein sobre el análisis de la cromatina unicelular. Es probable que ese objetivo se logre con éxito al final, dice, con «tecnologías que suponen un cambio radical respecto a lo que estamos utilizando ahora.»

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