Análisis evolutivo del gen gyrA de las cepas bacterianas de Neisseria meningitidis del complejo clonal 4821 recogidas en China entre 1978 y 2016

Análisis evolutivo de 77 secuencias nucleotídicas de gyrA de cepas CC4821 N.meningitidis

Se analizaron 77 secuencias de novo de gyrA de CC4821 N.meningitidis en el contexto de 149 secuencias de gyrA disponibles públicamente (enumeradas en la Tabla Adicional 1). Se construyó un árbol filogenético de unión de vecinos con el conjunto de datos resultante de 226 secuencias de nucleótidos de gyrA (Fig. 1). Se obtuvo un árbol similar utilizando el método de máxima verosimilitud (ML) (Figura adicional 1). Las secuencias de nucleótidos fueron significativamente divergentes con una distancia p global de 0,045 (Tabla 1). Una visión general del árbol mostró que las secuencias de las cepas CC4821 de N.meningitidis (en rojo en la Fig. 1) se encontraban en todo el árbol demostrando que el gen gyrA era relativamente divergente dentro de estas cepas.

Árbol filogenético de unión de vecinos de 226 secuencias del gen gyrA de cepas de Neisseria. El nombre de la cepa se indica de la siguiente manera: nombre de la especie-GB ID-identificación de la cepa-ST-CC-Serogrupo-país de recolección-año de recolección-fenotipo de resistencia al CIP. La información que falta se indica con un espacio vacío. Por ejemplo, N.meningitidis-AM889136.1-alpha14-ST53-CC53-cnl-Alemania-1999 S; Eikenella corrodens-CP034670.1-KCOM3110—–Corea del Sur-2017. Los nombres de las secuencias de las cepas CC4821 de N.meningitidis se indican en letra roja. Las 77 secuencias generadas en este estudio están subrayadas. Las secuencias de 9 cepas de referencia se indican con un punto negro. Se indican los valores Bootstrap > 70%. Los valores Bootstrap < 70% se indican entre paréntesis cuando es necesario. Los 9 grupos genéticos identificados en este estudio se indican con líneas verticales entre corchetes. El fenotipo de resistencia al PIC se indica con R para resistencia, S para sensible e I para fenotipo de resistencia intermedia

Entre las 226 secuencias analizadas, casi el 62% de las secuencias (140) se encontraron en la parte superior del árbol, sin un valor bootstrap significativo (Fig. 1). Estas secuencias eran muy homogéneas, con una distancia p de 0,003 (Tabla 1). Las 86 secuencias restantes eran más divergentes, con una distancia p de 0,066 en relación con las secuencias agrupadas en la parte superior del árbol. La mayoría de los nodos relativos a estas 86 secuencias presentaban un valor bootstrap > 70%. Además, la distancia p dentro de este grupo de 86 secuencias fue de 0,09, lo que demuestra que estas secuencias eran muy divergentes entre sí. Como los principales nodos del árbol presentaban un valor bootstrap > 80%, decidimos asignar arbitrariamente las secuencias a 9 grupos genéticos diferentes (Fig. 1; Tabla 1). Estos 9 grupos también se encontraron en el árbol ML (Figura adicional 1). Las secuencias gyrA de las cepas CC4821 se encontraron en 6 de estos grupos genéticos, a saber, el grupo 1, 2, 3, 5, 6 y 8.

El grupo 1 estaba formado por 2 secuencias, N.meningitidis-MK930374-100514-ST4832-CC4821-C-China-2005 y N.subflava-CP031251.1-M18660—-2009. Este grupo fue apoyado por un bootstrap del 100% sugiriendo que estas 2 secuencias eran muy diferentes del resto de las secuencias. Las secuencias compartían 7 amino cambios (Tabla 1, Tabla Adicional 2). Sin embargo, la larga rama correspondiente a la secuencia de N.subflava-CP031251.1-M18660—-2009 sugería que esta secuencia también era significativamente divergente de N.meningitidis-MK930374-100514-ST4832-CC4821-C-China-2005 y esto se confirmó por una distancia p de 0,06 entre estas 2 secuencias (Tabla 1).

El grupo 2 estaba formado por 2 secuencias de cepas de N.meningitidis recogidas en las provincias de Gansu y Guangxi en China en 2007 y 2011, a saber, N.meningitidis-KF733178-G1-ST5636-UA-B-China-2007-R y N.meningitidis-MK930446-GX34173-ST9477-CC4821-B-China-2011.

El grupo 3 estaba formado por una única secuencia, a saber, N.meningitidis-MK930402-231003-ST12300-CC4821-B-China-2009. El nodo correspondiente a esta secuencia fue apoyado por un valor bootstrap del 80%. Además, la distancia p por pares más baja entre esta secuencia y las demás secuencias analizadas fue de 0,032, lo que demuestra que esta secuencia era significativamente divergente en comparación con el resto de las secuencias analizadas (Tabla 1).

El grupo 5 estaba formado por 26 secuencias, principalmente de N.meningitidis, incluidas 9 de CC4821. Un subgrupo de 7 secuencias apoyadas por un bootstrap del 100% presentaba 5 secuencias de N.lactamica. Curiosamente, N.meningitidis-MK930398-140901-ST8241-CC4821-B-China-2009 se agrupó con secuencias de N.lactamica con un bootstrap del 100% y una rama larga.

El grupo 6 estaba formado por 27 secuencias de N.meningitidis (8 de CC4821) y 1 secuencia de N. cinerea, concretamente N.cinerea-LS483369.1-NCTC10294, que compartía un nodo con N.meningitidis-KF733132-59-ST7962-CC77-NG-China-2009-R. Sin embargo, la secuencia de N.cinerea presentaba una rama larga que sugería una divergencia significativa en comparación con la secuencia de N.meningitidis. Según los datos disponibles, las secuencias del grupo 6 parecían proceder de cepas resistentes al PIC. Sin embargo, estas cepas no compartían ninguna sustitución de aminoácidos única, lo que sugiere que no había ningún marcador común para el fenotipo de resistencia de estas cepas (Tabla adicional 2).

El grupo 8 contenía la mayoría de las secuencias de N.meningitidis (64%) analizadas en este informe. Las cepas se recogieron en los últimos 88 años en 13 países diferentes de 4 continentes. A pesar del importante lapso de tiempo y la dispersión geográfica, estas secuencias estaban muy conservadas, con una distancia p de 0,003. Además, estas secuencias procedían de cepas de 68 ST, 24 CC y 9 serogrupos, incluida la cepa de referencia 053442. En general, estas observaciones mostraron que el gen gyrA estaba altamente conservado entre la mayoría de las cepas de N.meningitidis a pesar de las diferentes características genéticas, ubicaciones geográficas o tiempo de recolección.

Análisis de la divergencia dentro de la proteína GyrA

La divergencia de aminoácidos dentro de la proteína GyrA se analizó entre 129 secuencias únicas (Tabla adicional 2). Se identificaron doscientas cincuenta y siete posiciones divergentes entre los 931 aminoácidos destacados en el alineamiento (Fig. 2). Aunque estos sitios se encontraban en toda la proteína, la distribución de la divergencia no parecía ser aleatoria. De hecho, dos regiones estaban altamente conservadas, desde las posiciones 530 a 620, y una región más pequeña entre 300 y 330. Según la proteína de E.coli, la primera región corresponde al final del dominio amino terminal y al principio del dominio carboxi terminal. La segunda región corresponde al dominio torre de la proteína según la estructura del modelo 3D (Fig. 2).

Divergencia de aminoácidos entre la proteína GyrA basada en 129 secuencias únicas. Las posiciones dentro del alineamiento largo de 932 aminoácidos se indican en el eje X. El porcentaje de secuencias que presentan una determinada posición divergente se indica en el eje Y (lado izquierdo). Por ejemplo, el 58% de las secuencias presentan una mutación en la posición 91. El gráfico de divergencia se generó a partir de la tabla de diferencias de aminoácidos que se muestra en la Tabla Adicional 2. La alineación presenta 10 huecos y el número de secuencias que presentan huecos se indica en el eje derecho y se muestra como un cuadrado negro. En la parte inferior se muestra un mapa de la proteína GyrA de E.coli con los dominios estructurales y funcionales para su comparación. El mapa se generó a partir de las siguientes referencias. Se comparó la secuencia de la proteína GyrA de E.coli y la cepa de referencia de N.meningitidis 053442 (GB-ID CP000381) (Tabla adicional 4). Se muestran los sitios resistentes al CIP conocidos en E.coli y las posiciones correspondientes en N.meningitidis se indican con una línea azul. Cabe destacar que entre los 8 sitios resistentes conocidos en E.coli, sólo las posiciones 83 y 87 son divergentes en N.meningitidis (sitios 91 y 95)

Entre las 257 posiciones divergentes, ninguna fue compartida por todas las secuencias gyrA analizadas de las cepas CC4821. Cinco sitios (91, 417, 665, 210 y 288) eran altamente divergentes, el 40% o más de las 129 secuencias estaban mutadas en estas posiciones. Por ejemplo, el 48% de las 129 secuencias presentaban un residuo mutado en la posición 417 (Fig. 2). Una posición (91) parecía estar vinculada a la resistencia al CIP, todas las cepas que no eran sensibles al CIP estaban mutadas en esta posición, presentando una I o una F o una V (Tabla adicional 2).

Identificación de posibles marcadores de resistencia al CIP

Entre las 226 secuencias analizadas, 174 eran de cepas sometidas a pruebas de resistencia al CIP (Tabla adicional 1). Para este estudio se analizaron 67 cepas. Como se ha mencionado anteriormente, todas las cepas que no eran sensibles al CIP (ya sea con un fenotipo resistente (R en el árbol) o intermedio (I en el árbol)) estaban mutadas en la posición 91. Esto demostró que una mutación en la posición 91 estaba relacionada con el mecanismo de resistencia. Entre las 67 cepas analizadas en este estudio, 49 estaban mutadas en la posición 91, pero 23 de ellas tenían un fenotipo de resistencia intermedio. Esto sugiere que otras posiciones podrían estar implicadas en el mecanismo de resistencia. Con el fin de identificar otros posibles marcadores de resistencia, las 226 cepas se analizaron más a fondo en cada posición mutada. Un cambio que se encontrara en las cepas resistentes (incluyendo el fenotipo de resistencia intermedia) pero que no se encontrara en ninguna de las cepas sensibles se calificaría. Sin embargo, para aumentar el rigor del análisis, no se consideraría una mutación encontrada en una sola cepa. En total, se identificaron 33 sitios (Tabla adicional 3; parte izquierda de la Tabla adicional 4). Por ejemplo, H8N se encontró en 18 cepas resistentes (incluyendo 2 con fenotipo intermedio) pero no apareció en ninguna cepa sensible. Se analizaron las 226 cepas para estas 33 posiciones. Una vez más, para aumentar el rigor del análisis, se descartó una mutación encontrada en al menos una cepa sensible. Así, la mutación D95N encontrada en cepas resistentes y sensibles no se consideró más. En total, se analizaron 39 mutaciones (algunas en la misma posición, como la posición 91) (en verde en la parte izquierda de la Tabla Adicional 4). Se construyó un perfil de mutaciones para las 128 cepas que presentaban al menos una mutación de interés (Tabla adicional 3). Se identificaron 46 perfiles diferentes, lo que significa que había 46 combinaciones de estas 39 mutaciones entre todas las cepas analizadas (lado derecho de la Tabla Adicional 4). Dieciséis de los 46 perfiles de mutación se referían a las cepas CC4821 (números en rojo en la Tabla Adicional 4). Veintiséis perfiles se referían a cepas que se sabía que eran resistentes al PIC (nombres de las cepas en letra azul en la Tabla adicional 4). Entre los 39 marcadores de resistencia potencial, las mutaciones N103D y T91I fueron las más compartidas en los perfiles, con 29 y 27 apariciones respectivamente. Sin embargo, cabe destacar que otras mutaciones también estuvieron bien representadas como H8N, I111V, E793Q y A679S con 23, 21, 18 y 17 apariciones respectivamente. También cabe destacar que el 45% de las cepas resistentes (58 de 128) sólo presentaban la mutación T91I. Como los marcadores de resistencia se describieron inicialmente en E.coli, fue necesario comparar las secuencias de gyrA de E.coli con las de la cepa de referencia N.meningitidis 53.442 para comprobar la posición de estos marcadores en la secuencia de E.coli (Tabla adicional 5).

Recombinación dentro del gen gyrA entre N. spp.

El análisis filogenético identificó posibles recombinantes. Por ejemplo, el grupo 1 fue de particular interés, en lo que respecta a N.meningitidis-MK930374-100514-ST4832-CC4821-C-China-2005 y N.subflava-CP031251.1-M18660. Estas dos secuencias compartían 7 cambios de residuos, no observados en otras cepas. Además, 5 de estos cambios se observaron en 30 aminoácidos (Tabla 1). Por último, los cambios de aminoácidos observados en una cepa no se vieron en la otra, como la posición 740 y 750. Todas estas observaciones sugieren una recombinación entre estas dos cepas, que fue confirmada por un análisis BootScan (Fig. 3a). Otras tres recombinaciones potenciales fueron confirmadas por BootScan. La Fig. 3b describía una recombinación entre una cepa CC4821 (probablemente N.meningitidis-MK930428-421615-ST10235-CC4821-B-China-2016 o N.meningitidis-CP000381.1-053442-ST4821-CC4821-C-China-2004_R) y N.cinerea-LS483369.1-NCTC10294 —–. La Fig. 3c presentaba múltiples eventos de recombinación entre N.lactamica-CP031253.1-M17106—– y dos cepas de N.meningitidis, N.meningitidis-KJ415206.1-54-R6—– y N.meningitidis-CP000381.1-53,442-ST4821-CC4821-C-China-2004_R. Por último, en la Fig. 3d aparece una recombinación entre cepas de N.meningitidis. En conjunto, el análisis de recombinación mostró que el gen gyrA de las cepas de Neisseria es muy propenso a la recombinación.

Eventos potenciales de recombinación inter e intraespecífica entre cepas de Neisseria. a. Recombinación entre N.subflava y N.meningitidis. Se generó un gráfico BootScan en SimPlot con N.meningitidis-MK930374-100514-ST4832-CC4821-C-China-2005 como consulta. b. Recombinación entre N.cinerea y N.meningitidis. Se generó un gráfico BootScan en SimPlot con N.meningitidis-KF733132-59-ST7962-CC77-NG-China-2009-R como consulta. c. Recombinación entre N.lactamica y N.meningitidis. Se generó un gráfico BootScan en SimPlot con N.meningitidis-MK930398-140901-ST8241-CC4821-B-China-2009 como consulta. d. Recombinación entre cepas de N.meningitidis. Se generó un gráfico BootScan en SimPlot con N.meningitidis-MK930446-GX34173-ST9477-CC4821-B-China-2011 como consulta. La cepa que se predice que contribuye más en el proceso de recombinación (columna vertebral) se muestra como una línea roja. La cepa de referencia N.meningitidis 053442 (GB ID CP000381) se muestra como una línea negra. Arriba se muestra un mapa funcional para la cepa de referencia 053442 basado en el mapa funcional de E.coli mostrado en la Fig. 2