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Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos

Manual de análisis bacteriológico (BAM) Página principal

Autores: Sandra M. Tallent, Reginald W. Bennett y Jennifer M. Hait

Historia de revisiones:

  • Junio de 2017 – Se añadió el nuevo capítulo 13B al Manual Analítico Bacteriológico
  • Enero de 2018 – Se corrigió el hipervínculo para el formulario 4 del CDC APHIS/CDC

La intoxicación alimentaria por estafilococos (SFP) es una intoxicación resultante del consumo de alimentos contaminados con niveles adecuados de enterotoxinas preformadas. Los síntomas de la SFP se manifiestan entre 2 y 8 horas después de la ingestión e incluyen náuseas, vómitos, calambres abdominales con o sin diarrea que suelen resolverse en 24-48 horas. (Argudin et al., 2010). El número de personas afectadas por el SFP es sólo una estimación debido a los errores de diagnóstico y a los brotes menores que no se notifican. La hospitalización es poco frecuente, pero se ha observado en personas inmunocomprometidas, en particular los ancianos y los muy jóvenes (Scallan et al., 2011).

Los estafilococos están normalmente presentes en la piel y las membranas mucosas humanas, con aproximadamente un 20-30% para la colonización persistente y un 60% para la intermitente (Kluytmans et al., 2005). Los manipuladores de alimentos colonizados por estafilococos enterotoxigénicos se consideran la principal fuente de contaminación de los alimentos por contacto directo con los productos o las superficies de contacto. Los animales, como el ganado lechero, también pueden ser portadores de estafilococos y constituir una fuente de contaminación de la leche y los productos lácteos. Por último, los estafilococos presentes en el medio ambiente pueden transferirse a los productos alimenticios sirviendo como fuente potencial de contaminación (Gutiérrez et al., 2012).

Los alimentos comúnmente relacionados con el SPP incluyen alimentos procesados, carne, aves de corral, productos lácteos y productos de panadería. Una vez que el alimento está contaminado, puede producirse el crecimiento de estafilococos y la producción de enterotoxinas, especialmente si no se siguen las buenas condiciones de fabricación que impiden el crecimiento, como las condiciones de almacenamiento refrigerado o los pasos de eliminación por calor, como la pasteurización (Gutiérrez et al., 2012). Las enterotoxinas estafilocócicas son estables al calor y no se desnaturalizan a menos que se expongan a altas temperaturas durante largos períodos, es decir autoclave a 121°C (250°F) a 15 PSI durante 60 minutos (CDC, 2007).

Staphylococcus aureus es el más comúnmente vinculado a los brotes de intoxicación alimentaria por estafilococos, pero otros estafilococos enterotoxigénicos coagulasa positivos como S. hyicus y S. intermedius también han sido implicados en brotes (Hennekinne et al., 2010). Las enterotoxinas estafilocócicas (SE) son exotoxinas pirogénicas con actividad superantigénica. Las enterotoxinas son proteínas globulares resistentes al calor y a las proteasas con un tamaño molecular medio de unos 25 kDa. Las estimaciones de la cantidad de toxina necesaria para causar la enfermedad son muy bajas. En un brote relacionado con la leche de chocolate se detectaron niveles de SEA de 0,5ng/ml (Evenson et al., 1988) y en un brote relacionado con la leche en polvo se detectaron 0,38ng/ml de SEA (Asao, et al., 2003).

Las SE clásicas (SEA-SEE) y las no clásicas, SEG, SEH, SEI, SER y SET tienen una actividad emética demostrada. Todavía no se ha demostrado la actividad emética de las enterotoxinas tipo SElJ-SElQ, SElS, SElU y SElV. Todos los genes se y sel se han localizado en elementos genéticos móviles, incluyendo bacteriófagos, islas de patogenicidad, plásmidos o transposones (Argudin et al., 2012).

La detección de SEs es primordial para la seguridad alimentaria y la protección del suministro de alimentos. Los métodos de detección de SE se basan en inmunoensayos polivalentes (ELISA) o inmunoensayos fluorescentes ligados a enzimas (EFLA) disponibles en el mercado con anticuerpos que detectan SEA-SEE. Los métodos monovalentes son específicos para las SEA-SEE y pueden utilizarse para distinguir estos tipos. Los métodos requieren la extracción de la enterotoxina del alimento sospechoso antes del análisis. La sensibilidad y la selectividad del método mejoran con la concentración por diálisis del extracto del alimento, pero las limitaciones de tiempo pueden requerir pruebas preliminares sin concentración. Sin embargo, la concentración por diálisis debe realizarse en todos los productos lácteos antes del análisis (Hennekinne et al., 2012).

PREOCUPACIÓN: Las enterotoxinas estafilocócicas son muy tóxicas y los procedimientos que pueden crear aerosoles deben realizarse en una cabina de seguridad biológica (BSC) aprobada. Las enterotoxinas estafilocócicas (SEA, SEB, SEC, SED y SEE) son agentes selectos. Los científicos deben seguir las directrices establecidas por los CDC: https://www.selectagents.gov/faq-general.html.

  1. Equipos y materiales especiales
    1. Sala de temperatura controlada o refrigerador 2-8°C.
    2. Batidora u homogeneizador.
    3. Incubadora 35-37°C.
    4. Balanza analítica y botes de pesaje.
    5. Bandeja para diálisis.
    6. Medidor de pH. El pH durante la extracción y el pH de los tampones utilizados en la extracción son importantes. Realice los ajustes con un margen de ± 0,1 unidades de pH.
    7. Centrífuga refrigerada a 2-8°C.
    8. Material de laboratorio de vidrio o polipropileno para evitar la adsorción de toxinas.
    9. Se utiliza una tela filtrante para recoger los restos después de la centrifugación. A menudo, se utilizan varias capas de estopilla gruesa prehumedecida para realizar esta tarea.
    10. Funnel separador.
    11. Membrana de diálisis MWCO 6.000-8.000 Daltons (por ejemplo, Spectra/Por® con cierres) de ancho plano 23 ± 2 mm.
    12. Dispositivos de filtración de tubos cónicos al vacío (membrana de 0,22µm) como Steriflip (EMD Millipore) recomendados para filtrar sobrenadantes de cultivos líquidos como medida de seguridad para evitar la aerosolización de enterotoxinas.
    13. Cabina de seguridad biológica.
  2. Reactivos

    Nota: los fabricantes de kits pueden requerir diferentes tampones o disolventes.

    1. Solución salina tamponada con fosfato (PBS) pH 7,3 + 0,2 (NaCl/Na2HPO4: 145 mM/10 mM) para preparar 1L de PBS disolver 9 g de NaCl y 3,58 g de Na2HPO4 en 1L de agua destilada. Ajustar el pH a 7,2 ± 0,2 utilizando HCl.
    2. Cloruro de sodio (NaCl).
    3. Fosfato de sodio (Na2HPO4).
    4. Polietilenglicol (PEG) (20.000 mol en peso) Preparar una solución de PEG al 30% (p/v) añadiendo 30 g de PEG por cada 70 ml de agua destilada.
    5. 1 N (o 0,1 N) de NaOH.
    6. 1 N (o 0,1 N) de HCl.
  3. Preparación de la membrana de diálisis
    Corte la membrana de diálisis lo suficientemente larga como para que quepa el extracto de alimentos que se va a concentrar. Sumergir el tubo en 2 cambios de agua destilada para eliminar el recubrimiento de glicerina. Usar un cierre de membrana o atar un extremo del tubo con 2 nudos cercanos. Llenar el tubo con agua destilada y comprobar si hay fugas apretando el saco lleno mientras se mantiene el extremo abierto bien cerrado. Vacíe el saco y colóquelo en agua destilada hasta su uso.
  4. Extracción de enterotoxina de una porción de alimento

    NOTA: este procedimiento y otros procedimientos que puedan generar aerosoles de microorganismos patógenos o enterotoxinas deben realizarse en una cabina de bioseguridad aprobada.

    1. Si es posible, muela todo el producto alimenticio o porciones de selecciones representativas del producto en una licuadora para homogeneizar la muestra de modo que cualquier SE presente en el alimento se distribuya uniformemente.
      1. Para los quesos con corteza, tome una muestra de queso con un 10% de corteza y un 90% de queso.
      2. Para los productos secos, utilice cantidades iguales de agua con el producto para mezclar o siga las instrucciones del fabricante.
    2. Pese 25 g de muestra en un vaso de precipitados de vidrio y transfiera la porción de prueba a una licuadora con 40 ml de agua destilada y mezcle a alta velocidad durante 3 minutos generando una papilla homogeneizada. No añadir agua a las muestras líquidas, sino proceder al paso 3.
    3. Dejar que la toxina se difunda agitando la muestra a temperatura ambiente durante 30 minutos.
    4. Acidificar la mezcla con HCl 0,1N hasta alcanzar un pH entre 3,5 y 4,0. Nota: si el pH desciende por debajo de 3,0 debe prepararse otra porción de 25 g.
    5. Transfiera la mezcla acidificada a tubos cónicos de propileno de 50 ml. Centrifugar a 3.130 × g durante 20 minutos a 5°C. Pueden utilizarse velocidades más bajas con un tiempo de centrifugación más largo, pero la limpieza de algunos alimentos no es tan eficaz. La separación de materiales grasos es ineficaz a menos que los alimentos se centrifuguen a temperatura refrigerada.
    6. Decantar el líquido sobrenadante en un vaso de precipitados de 800 ml a través de una gasa u otro material filtrante adecuado colocado en un embudo de separación. Si el sobrenadante no es claro, centrifugar de nuevo y decantar el líquido a través de la estopilla. Probar el pH, que debe estar entre 3,5 y 4,5. Si el pH es correcto, neutralizar la mezcla con NaOH 0,1N para obtener un pH entre 7,4 y 7,6.
    7. Si el pH es >4,5 repetir la acidificación, pero si <3,0 o=»»>9,0 repetir el proceso con otra porción de 25 g de alimento.
    8. Si hay suficiente muestra disponible para repetir la prueba, se puede extraer una alícuota para el cribado mediante un ensayo validado (véase la sección H). Si los resultados del cribado son negativos, el extracto restante debe concentrarse con diálisis y volverse a analizar.
  5. Concentración del extracto con diálisis
    1. Colocar el extracto en un saco de diálisis preparado. Colocar el saco cerrado en una bandeja y sumergir el saco en PEG al 30% (p/v). Mantener a 5°C hasta que el volumen se reduzca a 15-20 ml o menos. Este proceso puede durar entre 24 y 72 horas, pero si el volumen no se reduce después de mantenerlo toda la noche, añadir PEG en polvo a la bandeja. Retirar el saco del PEG y lavar bien el exterior con agua para eliminar el PEG adherido al saco. Sumergir en agua destilada durante 1-2 minutos. Verter el contenido en un vaso de precipitados pequeño.
    2. Enjuagar el interior del saco con 2-3 ml de agua destilada (se utiliza PBS para la leche y los productos lácteos) pasando los dedos por el exterior del saco para eliminar el material adherido a los lados del tubo. Repita el enjuague hasta que el enjuague sea claro. Mantenga el volumen lo más pequeño posible.
    3. Ajuste el pH del extracto a 7,4-7,6.
    4. Los extractos concentrados deben analizarse en un plazo de 48 horas y almacenarse a 3-5°C, de lo contrario, congele los extractos a 18-20°C y descongélelos completamente a 3-5°C antes de la prueba. Algunos ensayos, como el Vidas SET2, requieren un análisis inmediato.
  6. Prueba de SE a partir de cultivos bacterianos

    Las cepas de estafilococos sospechosas de producir enterotoxinas pueden enriquecerse previamente en caldo nutritivo como TSB o BHI.

    1. Transfiera dos o tres colonias morfológicamente similares a 10 mL de caldo nutritivo.
    2. Incubrir a 35-37°C durante la noche en un agitador orbital.
    3. Centrifugar los cultivos 5 minutos 3500 × g a 10°C
    4. Filtrar el sobrenadante utilizando un dispositivo de filtrado al vacío Steri-Flip con un filtro de 0,22µm u otro sistema cerrado para evitar la aerosolización de enterotoxinas. Este procedimiento debe realizarse en una cabina de seguridad biológica para garantizar la seguridad del científico.
    5. Los sobrenadantes de los cultivos pueden tener niveles elevados de SE que están fuera del rango lineal del kit pueden requerir la dilución con PBS.
  7. Informar de los resultados

    La presencia de enterotoxina estafilocócica detectada en productos alimentarios se notificará al Programa Federal de Agentes Selectos gestionado por el Centro de Control y Protección de Enfermedades (CDC): https://www.selectagents.gov/form4.html rellenando el formulario 4 del APHIS/CDC.

    Los resultados positivos se notificarán como enterotoxina estafilocócica detectada en × g (ml) de producto. Los resultados negativos se notificarán como enterotoxina estafilocócica no detectada en × g (ml) de producto.

  8. Notas

    El kit debe ser capaz de detectar la enterotoxina al nivel mínimo de 0,05ng/g con altos niveles de sensibilidad relativa (>90%) y especificidad relativa (>90%).

    La mención de nombres comerciales o de productos comerciales en el método se hace únicamente con fines de información científica y no implica recomendación o aprobación por parte de la U. S. Food and Drug Administration. Dos métodos que se utilizan comúnmente para la detección de SE incluyen el Vidas SET2 (bioMerieux, Inc), aprobado por la AOAC, que es un ensayo fluorescente polivalente automatizado ligado a enzimas (EFLA) que detecta SEA-SEE (Método oficial de la AOAC 2007.06 VIDAS SET2 para la detección de enterotoxina estafilocócica en alimentos seleccionados, Acción Final, 2010). El número de catálogo actual de Vidas Set2 es Ref. 30705. El Ridascreen SET Total (R-Biopharm AG) es un inmunoensayo manual ligado a enzimas que se realiza en pocillos recubiertos con anticuerpos polivalentes. El kit polivalente Ridascreen detecta las enterotoxinas estafilocócicas SEA-SEE y ha sido validado y verificado mediante ensayos en anillo y estudios de validación de terceros dirigidos por el Laboratorio de Referencia de la Unión Europea para estafilococos coagulasa positivos para el mandato del Comité Europeo de Normalización (CEN) propuesto por la norma ISO 19020. Existe un kit monovalente Ridascreen Set A,B,C,D,E (R-Biopharm AG), pero este kit no ha sido validado por una tercera parte. El número de catálogo del kit polivalente Set Total es R4105 (96 pruebas) o R4106 (48 pruebas) . El número de catálogo del kit monovalente SET A,B,C,D,E es R4101.

Interferencias

Pueden producirse reacciones no específicas en productos alimentarios que tienen enzimas endógenas como la lactoperoxidasa o la fosfatasa alcalina e interferir con kits como el Vidas SET2 que utiliza la fosfatasa alcalina como enzima de detección (Vernozy-Rozand, et al., 2005). Se recomienda que todos los resultados positivos se confirmen con un método alternativo que utilice una enzima de detección diferente. En el caso del Vidas SET2, un método alternativo es el Ridascreen SET Total que utiliza lactoperoxidasa.

Puede aplicarse un tratamiento térmico para eliminar la fosfatasa alcalina endógena de la muestra de la siguiente manera:

  • Transfiera 600 μL de extracto concentrado a un tubo
  • Caliente a 80°C durante 2 minutos
  • Repita el ensayo Vidas SET2 con el concentrado enfriado. Puede producirse alguna pérdida de enterotoxina.

Si se sospecha que el resultado es inexacto utilizando el Ridascreen u otro kit que utilice lactoperoxidasa, transfiera 100 μL de extracto concentrado a un tubo. Añada 50 μL de cada una de las soluciones del sustrato y del kit de cromágeno. Mezcle y observe si aparece un color azul-verde. Si aparece un color azul-verde, es indicativo de que la lactoperoxidasa intrínseca está presente en la muestra e interfiere con el ensayo. Por lo tanto, debe utilizarse un método de detección diferente.

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