Endoplasmatischer Retikulum-assoziierter Abbau (ERAD)

2.1 Proteinfaltungsprozess und Erkennung fehlgefalteter Proteine

Ungefähr 30% der Gesamtproteine und alle Transmembranproteine der Zelle werden im ER synthetisiert, das als Portal für den Eintritt in den sekretorischen Weg über den Sec61-Kanal dient. Während der Translokation wird die N-terminale hydrophobe Signalsequenz des neu synthetisierten Proteins durch einen Peptidasekomplex gespalten. Ko- und posttranslationale Modifikationen wie die Bildung von Disulfidbindungen, erste Schritte der N-Glykosylierung und die Verankerung von Glykophosphatidylinositol (GPI) finden im ER statt.

Die oxidierende Umgebung des ER fördert die Bildung von Disulfidbindungen, die die tertiäre Proteinstruktur stabilisieren und den Zusammenbau des Proteins erleichtern. Während des Faltungsprozesses werden Disulfidbindungen durch die Oxidation von Paaren freier Thiole an Cysteinresten durch Proteindisulfidisomerasen (PDIs) gebildet. PDIs wirken als Zyklus, und nach der anfänglichen Oxidation werden Disulfidbindungen manchmal von PDI und ERp57, einer Thiol-Oxidoreduktase, isomerisiert, um die korrekte Faltung des Proteins zu stabilisieren. Umgekehrt ist die Reduktion von Disulfidbindungen fehlgefalteter Proteine für den Retrotranslokationsschritt von ERAD notwendig. Tatsächlich ermöglicht PDI die Retrotranslokation des Simian-Virus-40 (SV-40) und des Choleratoxins. ERdj5, eine ER-Oxidoreduktase, reduziert Disulfidbindungen und interagiert mit EDEM (ER-degradation enhancing mannosidase-like protein) und beschleunigt ebenfalls den Schritt der Retrotranslokation von SV-40 . ERDJ5 reguliert auch den Abbau der krankheitsverursachenden α1-Antitrypsin-Variante (Null-Hongkong).

Die Faltung wird durch molekulare Chaperone unterstützt, die vor Fehlfaltung und Entfaltung schützen. Chaperon-ähnliche Glykane binden an N-Glykane, die eine entscheidende Rolle bei der Faltung und dem Abbau von Proteinen spielen. Es ist offensichtlich, dass N-Glykosylierung, Qualitätskontrolle der Proteinfaltung und ERAD funktionell miteinander verbunden sind. Nach dem Eintritt in das ER wird ein Großteil der neu synthetisierten Polypeptidkette N-verknüpft glykosyliert. Das Oligosaccharyltransferase-Enzym erkennt die Asn-X-Ser/Thr-Konsensussequenz im größten Teil des naszierenden Proteinmoleküls und baut kovalent eine mannosehaltige Kernglykangruppe (Glc3Man9GlcNAc2) aus dem an der ER-Membran lokalisierten Dolichol in das Protein ein. Aufgrund der sehr kurzen Halbwertszeit der triglykosylierten Form des proteingebundenen Oligosaccharids beginnt die Glykanverarbeitung unmittelbar nach der Übertragung der Vorläuferglykangruppen durch Glucosidase-Enzyme. Nach Abspaltung von zwei der drei Glukosereste kann das entstehende Protein mit Qualitätskontrolllektinen wie CNX und CLR interagieren. Diese Wechselwirkung bleibt bis zur Abspaltung des verbleibenden Glukoserestes erhalten. Nach der Freisetzung des Glykoproteins aus dem CNX/CLR-Zyklus wird auch die letzte Glukose abgespalten, wodurch ein unglykosyliertes Substrat entsteht. Dadurch wird die Interaktion des Substrats mit den Lektin-Chaperonen beeinträchtigt. Wenn das Protein in diesem Stadium richtig gefaltet ist, kann es das ER verlassen und sein endgültiges Ziel erreichen. Ist das Glykoprotein jedoch noch nicht gefaltet, wird es im ER zurückgehalten und von der UDP-Glukose-Glykoprotein-Glukosyltransferase erneut glukosyliert und mit CNX und CLR verbunden, wodurch das Protein mehr Zeit für die richtige Faltung erhält. Die Mechanismen, die an der Beendigung der Reglykosylierungs-/Deglykosylierungszyklen beteiligt sind, sind noch nicht geklärt. Es ist jedoch klar, dass, wenn die Polypeptidkette nach wiederholten Faltungsversuchen nicht ihre reife Form erreichen kann, die terminalen Mannosereste der Kernglykankette schrittweise durch ER α1,2-Mannosidase I (ERMan1) entfernt werden. ERMan1 erzeugt das Isomer Man8GlcNAc2, indem es einen Mannoserest aus dem mittleren Ast der N-Glykane entfernt. Durch dieses Trimmen werden Glykoproteine zu schlechteren Substraten für die Reglykosylierung und den Austritt aus dem CNX-Zyklus.

Die hydrophoben Bereiche von richtig gefalteten Proteinen sind normalerweise im Inneren von löslichen Proteinen verborgen. Bei fehlgefalteten Proteinen können diese Bereiche jedoch freigelegt sein. Wenn ein Protein freiliegende hydrophobe Oberflächen hat, bindet BiP daran, um diese aggregationsanfälligen Oberflächen für ordnungsgemäße Faltungsversuche zu verbergen, indem es die Aggregation verhindert. Gelingt die Faltung jedoch nicht oder verzögert sie sich, dient die erweiterte Interaktion zwischen Chaperon und fehlgefaltetem Protein für einen ausgeklügelten Prozess, bei dem das Protein auf andere Chaperone und/oder den ERAD-Prozess übertragen wird.

Es ist allgemein anerkannt, dass der erste Schritt des ERAD-Prozesses die Auswahl fehlgefalteter Proteine durch Chaperone ist. Bereits 1999 wurde festgestellt, dass sich die ERAD-Substrate der Hefe in ihrem Bedarf an dem ER-luminalen Hsp70, BiP, auffallend unterscheiden. Der Abbau von löslichen Substraten wie pαF und einer mutierten Form der vakuolären Protease Carboxypeptidase Y* (CPY*) war von BiP abhängig, während der Abbau der Transmembranproteine Pdr5*p, Ste6-166p, Sec61-2p und Hmg2p unabhängig von BiP erfolgte. Im Jahr 2004 wurde gezeigt, dass Substrate mit einer zytosolischen Domäne wie Ste6-166p BiP-unabhängig abgebaut wurden, während Proteine mit luminalen Defekten BiP benötigten, was darauf hindeutet, dass je nach Topologie der fehlgefalteten Läsion (ER-Lumen, ER-Membran und Zytoplasma) zytosolische oder luminale Chaperone bei der Erkennung und Ausrichtung für den Abbau fungieren.

Es ist möglich, die Substraterkennung während des ERAD anhand von Modellproteinen mit Fehlfaltung zu untersuchen. Es ist klar, dass die De-Mannosylierung für den Abbau fehlgefalteter Glykoproteine erforderlich ist, da die Hemmung dieses Mannose-Trimmings fehlgefaltete Glykoproteine im ER stabilisiert. Die Überexpression von ERMan1 beschleunigt den Abbau von N-glykosylierten Proteinen. Das resultierende Man8-GlcNAc2 enthaltende Glykoprotein wird nach diesem Trimming zu einem Substrat für EDEM1 (ER-degradation enhancing mannosidase-like protein 1, Htm1p in Hefe), ein Mannosidase-verwandtes Lektin im ER. Es wurde ferner vorgeschlagen, dass fehlgefaltete Glykoproteine mit ERManI und EDEM1 für ihren ERAD interagieren, und die Lektin-Kohlenhydrat-Interaktion erwies sich als entscheidend für die EDEM-Substraterkennung. Obwohl ERMan1 als biologischer Zeitgeber vorgeschlagen wurde, der den ERAD fehlgefalteter Proteine einleitet, haben neuere Studien gezeigt, dass Mannosidasen nicht allein für die intensive Demannosylierung während des ERAD verantwortlich sind, insbesondere unter nichtbasalen Bedingungen. Unter ER-Stressbedingungen (unfolded protein response active) erhöht die transkriptionelle Erhöhung von EDEM1 die ERAD-Effizienz, indem sie die proteolytische Downregulation von ERMan1 unterdrückt. Es zeigte sich, dass EDEMs auch eine wichtige Rolle bei der Demannosylierung von Substraten spielen. EDEM1 verhindert auch die Reglykosylierung und fördert die Retrotranslokation und den Abbau einiger ERAD-Substrate. Während die Mannosidase-Homologie-Domäne (MHD) von Htm1p für die Substratbindung notwendig ist, bindet EDEM1 bei Säugetieren fehlgefaltete Proteine unabhängig von der MHD-Domäne, so dass die EDEM1-Substratbindung möglicherweise keine Mannose-Trimmung oder sogar Glykosylierung erfordert. Somit kann EDEM1 zusätzlich zu den N-gebundenen Oligosaccharideinheiten von Glykoproteinen auch die Faltungsläsionen fehlgefalteter Proteine erkennen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass EDEMs direkt oder indirekt an der Demannosylierung von Glykoproteinen beteiligt sind und/oder als Rezeptoren dienen, die Mannose-getrimmte Proteine binden und für ERAD anvisieren (Abbildung 1).

Durch die Abtrennung der terminalen Mannose vom Ast C werden α-terminale α1,6-gebundene Mannosereste freigelegt, die als Erkennungssignal für ERAD-Lektine wie OS9 (Yos9 in Hefe) und XTP3-B dienen (Abbildung 2). Durch ihre Mannose-6-Phosphat-Rezeptor-Homologie (MRH)-Domäne erkennen beide Proteine in erster Linie die α1,6-gebundene Mannose j. Darüber hinaus erkennt OS-9 auch die α1,6-gebundene Mannose e und c.

Verschiedene Berichte deuten darauf hin, dass Faktoren (EDEMs, OS9 und XTP3-B), die für die Substraterkennung und -ausrichtung erforderlich sind, in supramolekularen Komplexen enthalten sind und/oder mit wichtigen ERAD-Regulatoren interagieren. So interagiert EDEM1 beispielsweise mit CNX, empfängt Substrate aus dem CNX-Zyklus und erleichtert den Abbau von ERAD-Substraten wie der NHK-α1-Antitrypsin-Mutante. EDEM1 assoziiert auch mit den Komponenten der ER-Retrotranslokationsmaschinerie. Es wird vermutet, dass EDEM1 fehlgefaltete Proteine bindet und seine MHD-Domäne nutzt, um fehlgeleitete Proteine an das ER-residente Glykoprotein SEL1L des Hrd1-SEL1L-Ubiquitin-Ligase-Komplexes zu binden. SEL1L bildet das Gerüst für mehrere luminale Substraterkennungsfaktoren und verbindet sie mit Hrd1. OS9 und XTP3-B assoziieren ebenfalls mit dem Hrd1-SEL1L-Komplex, zu dem auch BiP und GRP94 gehören. Außerdem soll XTP3-B BiP mit dem Hrd1-Komplex verbinden. Eine Hypothese besagt, dass diese drei Chaperone (EDEM1, OS9 und XTP3-B) als Oligomere funktionieren, wobei ein Monomer mit dem Substrat und ein anderes mit dem Hrd1-SEL1L-Komplex interagiert. Darüber hinaus interagiert EDEM1 auch mit Derlins, einem Transmembranprotein, das als Translocon in Frage kommt; darüber hinaus hat sich gezeigt, dass Derlin2 die Interaktion von EDEM1 mit der zytosolischen AAA-ATPase p97 verstärkt, die die ATP-Hydrolyse mit der Retrotranslokation fehlgefalteter Proteine koppelt.

Es ist klar, dass der Schritt der Substraterkennung beim ERAD ein komplizierter Mechanismus ist, an dem mehrere verschiedene Enzyme und Chaperone beteiligt sind, die unterschiedliche, aber aufeinander abgestimmte Rollen beim ERAD spielen. Außerdem variieren je nach Substrat die Anzahl und die Eigenschaften der beteiligten Proteine. So wurde beispielsweise eine konzertierte Rolle von EDEM, ERdj5 und BiP beim Abbau fehlgefalteter Proteine vorgeschlagen. Nach Verlassen des CNX-CLR-Zyklus schneidet EDEM1 die Man8-GlcNAc2-Glykanstruktur weiter ab und ERdj5 reduziert Disulfatbindungen. Zugleich aktiviert ERdj5 die ATPase-Aktivität von BiP. ADP-gebundenes BiP bindet an das fehlgefaltete Protein und hält es in der Form einer Retrotranslokationskomponente, bis es in den Retrotranslokationskomplex übergeht.

ERAD ist auch an der Qualitätskontrolle von nicht-glykosylierten Proteinen beteiligt, die unabhängig von lektinähnlichen Proteinen ist. Die leichte Kette des Immunglobulins (Ig-K-LC), ein nicht-glykosyliertes ERAD-Substrat, wird in Abhängigkeit von BiP abgebaut. Okuda-Shimizu und Hendershot haben einen ERAD-Weg für dieses nicht-glykosylierte BiP-Substrat und verschiedene Protein-Interaktionsdynamiken charakterisiert, die bei diesem Prozess eine Rolle spielen. Ig-K-LC hat zwei intramolekulare Disulfidbindungen, und seine vollständig oxidierte Form ist nicht in der Lage, vom ER ins Zytoplasma zu gelangen. BiP interagiert nur mit der teilweise oxidierten Form des Ig, verhindert die vollständige Oxidation von Ig-K-LC und erleichtert dadurch seine Freisetzung aus dem ER. Darüber hinaus wurde ein UBL-Domäne-enthaltendes Transmembranprotein, das homoCys-responsive ER-resident protein (HERP), als Rezeptor für nicht-glykosylierte BiP-Substrate identifiziert. HERP interagiert mit Derlin1, und das teilweise oxidierte Ig-K-LC wird von BiP auf den HERP-Derlin1-Hrd1-Komplex übertragen und anschließend dem proteasomalen Abbau zugeführt. Neben BiP ist auch ERdj5 als Disulfid-Reduktase für den ERAD von nicht-glykosylierten Proteinen von Bedeutung. Die von BiP erfassten nicht-glykosylierten Substrate werden zur Spaltung der Disulfidbindungen an ERdj5 weitergeleitet. Anschließend werden diese Substrate mit Hilfe von BiP zur Retrotranslokation an SEL1L weitergeleitet. Neben BiP sind sowohl OS9 als auch XTP3-B an der ERAD von nicht-glykosylierten Proteinen beteiligt.