ELISpot Assay Prinzip

ELISpot Assays verwenden die Sandwich-Enzymimmunoassay-Technik (ELISA). Ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper, der für den gewählten Analyten spezifisch ist, wird auf eine mit PVDF (Polyvinylidendifluorid) beschichtete Mikroplatte aufgetragen. Entsprechend stimulierte Zellen werden in die Vertiefungen pipettiert, und die Mikroplatte wird für eine bestimmte Zeit in einen befeuchteten 37 °C CO2-Inkubator gelegt. Während dieser Inkubationszeit bindet der immobilisierte Antikörper in unmittelbarer Nähe der sezernierenden Zellen den sezernierten Analyten. Nach dem Abwaschen von Zellen und ungebundenen Substanzen wird ein biotinylierter polyklonaler Antikörper, der für den gewählten Analyten spezifisch ist, in die Vertiefungen gegeben. Nach einem Waschvorgang zur Entfernung ungebundener biotinylierter Antikörper wird an Streptavidin konjugierte alkalische Phosphatase zugegeben. Ungebundenes Enzym wird anschließend durch Waschen entfernt, und eine Substratlösung (BCIP/NBT) wird zugegeben. Es bildet sich ein blau-schwarz gefärbter Niederschlag, der an den Stellen, an denen die Zytokine lokalisiert sind, als Flecken erscheint, wobei jeder einzelne Fleck eine einzelne Zelle repräsentiert, die den Analyten abgibt. Die Spots können mit einem automatischen ELISpot-Lesesystem oder manuell unter Verwendung eines Stereomikroskops gezählt werden.