Elektroporation und konkurrierende Transfektionsmethoden

Angelo DePalma Ph.D. Writer GEN

Durch ihre Vielseitigkeit – sie funktioniert mit jeder Zelle, jedem Organismus – ist die Elektroporation einzigartig vorteilhaft.

Die Elektroporation verwendet einen elektrischen Impuls, um neue Spezies, in der Regel polare Moleküle, in Zellen einzuführen. Die Technik nutzt die schwachen Wechselwirkungen zwischen Phospholipid-Doppelschichten, die die Integrität der Zellmembranen aufrechterhalten. In einer typischen Zellmembran sind die Phospholipide so angeordnet, dass ihre polaren Kopfgruppen nach außen und ihre hydrophoben Schwanzgruppen nach innen zeigen – eine Anordnung, die den Durchgang polarer Moleküle behindert. Ohne irgendeine Art von Unterstützung können polare Moleküle nicht eindringen.

Wenn Zellen einem kontrollierten elektrischen Impuls ausgesetzt sind, öffnet sich die Phospholipidschicht und es entstehen vorübergehende physikalische Kanäle, die den Eintritt von Molekülen ermöglichen. Unter den richtigen Bedingungen schließen sich die Kanäle schnell wieder, so dass die Zelle in ihren ursprünglichen Zustand zurückkehrt – mit der Ausnahme, dass die Zelle nun fremde Moleküle enthält.

Neben der direkten Einführung von Genen erleichtert die Elektroporation auch den direkten Transfer von Plasmiden zwischen Zellen oder Spezies – zum Beispiel von Bakterien auf Hefe.

Ausgiebig wird mit der Elektroporation experimentiert, um Medikamente und Impfstoffe direkt in die Zellen lebender Organismen zu bringen. Dieser Artikel konzentriert sich auf nicht-medizinische Anwendungen.

Die Elektroporation wird am häufigsten für die transiente Transfektion von Zellen verwendet, obwohl auch eine stabile Transfektion möglich ist. In der biopharmazeutischen Industrie ermöglicht die transiente Transfektion die Produktion von bis zu einigen Gramm Protein für die Charakterisierung und präklinische Studien. Bei dieser Anwendung hat sich die Elektroporation unter Verwendung von Plasmiden als zuverlässig und vorhersehbar erwiesen. Die Elektroporation führt ebenfalls zu stabil transfizierten Zellen, vorausgesetzt, dass die DNA in linearisierter Form eingeführt wird, indem sie zuvor mit einem Restriktionsenzym behandelt wird.

Eine Technik unter vielen

Die Elektroporation ist ein fester Bestandteil des Arsenals der Transfektionstechniken, zu denen virale Vektoren, chemische oder reagenzienbasierte Methoden und mechanische Genübertragung gehören. Virale Vektoren sind die gängigste Methode zur Erzeugung stabil transfizierter Zellen für die Herstellung von therapeutischen Proteinen. Virale Vektoren bieten eine sehr hohe Transfektionseffizienz, sind aber in Bezug auf die Länge der eingefügten DNA begrenzt. Virale Vektoren sind auch mit Problemen der biologischen Sicherheit und der Mutagenese konfrontiert.

Andere mechanische Techniken wie Mikropräzipitation, Mikroinjektion, Liposomen, Partikelbeschuss, Sonoporation, laserinduzierte Porierung und Bead-Transfektion werden alle experimentell eingesetzt. Diese mechanischen Techniken haben einen gemeinsamen Nenner. Sie zerstören die Zellmembranen und ermöglichen so das Eindringen von DNA in die Zelle. Bei einigen Ansätzen – zum Beispiel der „Genkanone“ – werden die Gene direkt durch die Membran in das Zytoplasma geschleudert. Von dort aus können die Gene in den Zellkern wandern.

Außerdem gibt es Hybridtechniken, die die Möglichkeiten mechanischer und chemischer Transfektionsmethoden nutzen. So sind in den letzten zehn Jahren zahlreiche Artikel über die Magnetofektion erschienen, eine Transfektionsmethode, die chemische Transfektion mit mechanischen Methoden kombiniert. So können beispielsweise kationische Lipide in Kombination mit Genkanonen oder Elektroporatoren eingesetzt werden. Der größte Teil der Literatur zur Magnetofektion befasst sich mit der Übertragung von Genen und therapeutischen Molekülen auf lebende Organismen.

Die Elektroporation hat mehrere Vorteile: Vielseitigkeit (funktioniert mit jedem Zelltyp), Effizienz, sehr geringer DNA-Bedarf und die Möglichkeit, in lebenden Organismen zu arbeiten. Zu den Nachteilen gehören potenzielle Zellschäden und der unspezifische Transport von Molekülen in die Zelle und aus der Zelle heraus.

Unter den chemischen, mechanischen und viralen Transfektionsverfahren bietet jedoch nur die Elektroporation eine hinreichende Erfolgsgarantie, unabhängig von der Zielzelle oder dem Zielorganismus.

Zum Beispiel sind die chemische Transformation und die Elektroporation zwei führende Verfahren zur Einführung von DNA in Escherichia coli. Bei letzterer müssen die Bakterien zunächst „kompetent“ gemacht werden, indem Puffersalze entfernt werden, um sicherzustellen, dass der Strom die Zellen erreicht, und dann der elektrische Impuls bei 0 °C angelegt wird, um die Mikroorganismen nicht zu schädigen. Bei der chemischen Transformation werden die Bakterien in CaCl2 suspendiert, wodurch Poren entstehen, gefolgt von einem Hitzeschock, durch den die DNA in die Zellen geschleust wird.

Bei einem anderen Ansatz werden kationische Lipide verwendet, um die Zellmembranen aufzubrechen. Die Elektroporation ist weniger umständlich und effizienter, funktioniert bei mehr verschiedenen Zelltypen und eignet sich besser für Standardmethoden als die chemische Transfektion. Einige Forscher bevorzugen jedoch die chemische Transfektion, weil dafür kein Instrument angeschafft werden muss.

Innovation ermöglichen

Obwohl die Elektroporation erstmals 1965 beschrieben wurde, eröffnet sie weiterhin Wege zu innovativer Wissenschaft in Bezug auf Instrumente, Protokolle und Experimente. Mindestens ein Dutzend Universitätsgruppen haben Elektroporationsgeräte entwickelt, die auf mikroelektromechanischen Systemen (MEMS) basieren. Ein Vorteil von Geräten mit Mikrokanälen besteht darin, dass sie so konstruiert werden können, dass sie nicht mehr Spannung anlegen, als für einen angemessenen Einbau von Makromolekülen erforderlich ist. Dieser Vorteil birgt aber auch einen Nachteil. Im Gegensatz zu kommerziellen Elektroporationssystemen funktionieren die Chips nicht mit allen Zellen.

Eine Gruppe am Department of Biomedical Engineering der Louisiana Tech University unter der Leitung von Shengnian Wang, Ph.D., hat herausgefunden, dass Goldnanopartikel die Leistung kommerzieller Elektroporationsgeräte verbessern.1 Wang glaubt, dass die Partikel, die sehr leitfähig sind, die Leitfähigkeit des Zellmediums verringern und gleichzeitig als „virtuelle Mikroelektroden“ fungieren, um die Öffnung von Phospholipidmembranen zu unterstützen. Er behauptet eine verbesserte Leistung (verbesserte DNA-Transporteffizienz) und eine höhere Lebensfähigkeit der Zellen aufgrund niedrigerer Porationsspannungen.

Forscher an der Charité Universitätsmedizin Berlin2 haben eine kombinierte Square-Pulse-Elektroporationsstrategie für die reproduzierbare Transfektion von Zellen entwickelt. Dr. Britta Siegmund und ihre Mitarbeiter suspendieren Zellen in Puffer und setzen sie einem ersten Hochspannungspuls aus, gefolgt von einem Niederspannungspuls mit unterschiedlicher elektrischer und zeitlicher Stärke. Dr. Siegmund behauptet, dass die Lebensfähigkeit mit der Standard-Elektroporation vergleichbar ist und dass die Transfektionseffizienz bis zu 95 % beträgt. Sie kommt zu dem Schluss, dass die Technik „leicht an Zellen angepasst werden kann, die als schwierig zu transfizieren gelten“

Neben dem üblichen DNA-Transfer wurde die Transfektion auch zur Einführung von interferierender RNA in verschiedene Zelltypen eingesetzt. Diese Technik ermöglicht die kontrollierte Untersuchung der Dosierung und der Effizienz der Übertragung im kleinen Maßstab. Probleme mit der Dosierung und Verabreichung haben die praktische Anwendung der RNA-Interferenz in der Therapie erschwert. Mindestens eine Studie hat jedoch die Frage aufgeworfen, ob RNA-Interferenzgene am effektivsten durch Transfektionsreagenzien oder Elektroporation in primäre Zellen eingebracht werden.3

Kirsty Jensen, Ph.D., und Kollegen von der Universität Edinburgh verglichen die Wirksamkeit von 11 transienten Transfektionsreagenz-Kits und Elektroporation für die Ausschaltung des immunmodulatorischen Mittelmeerfieber-Gens (MEFV) in aus Rindermonozyten abgeleiteten Makrophagen. Die Gruppe testete die Methoden für die Aufnahme der kleinen interferierenden RNA, den Knockdown des Zielgens, die Zelltoxizität und die Induktion der Interferonreaktion vom Typ I.

Die Elektroporation war beim Knockdown von MEFV ungefähr genauso wirksam wie die Transfektionsreagenzien. Im Gegensatz zu den Reagenzien löste die Elektroporation keine Interferonreaktion aus, aber die Lebensfähigkeit der Zellen war geringer. Fragen der Lebensfähigkeit und der Transfektionseffizienz bei der Elektroporation werden im Allgemeinen als oberflächliche Bewertung der Technik angesehen.

Dr. Jensen kam zu dem Schluss, dass „die Verwendung von Transfektionsreagenzien für unsere Arbeit, bei der wir die Rolle von Wirtsmakrophagengenen bei der Reaktion auf die Infektion untersuchen, besser geeignet ist als die Elektroporation“, dass aber „die Entscheidung, ob kleine interferierende RNA in Zellen transfiziert oder elektroporiert wird, von den einzelnen Experimenten abhängt.“

Zumindest in einigen Fällen, in denen die Ergebnisse der Elektroporation suboptimal sind, haben die Forscher es versäumt, andere Bedingungen als die elektrische Impulsstärke zu optimieren. Wie Hu und Mitarbeiter kürzlich feststellten,4 wird die Wirksamkeit der Elektroporation von nicht-elektrischen Faktoren wie dem Zell- oder Gewebetyp und der DNA-Formulierung beeinflusst.

Die Elektroporation ist zu einer unverzichtbaren Methode sowohl für die In-vitro- als auch die In-vivo-Entwicklungsbiologie geworden. Ein großer Teil dieser Arbeit findet in einzelnen Zellen statt, was zu einem Modell von großem Interesse für Therapeutika, Diagnostik, Arzneimittelabgabe und Zellbiologie beiträgt. Die direkte Nanoporation einzelner Zellen ist aufgrund der Ungewissheit bezüglich der Lebensfähigkeit nach dem Einbau schwierig.

Forscher an der Northwestern University haben eine Einzelzelltechnik entwickelt, die eine hohe Lebensfähigkeit und Effizienz bietet.5 Ihr Ansatz verwendet eine mikrofabrizierte Auslegervorrichtung, die Nanofontänensonde (NFP). Sie bringt Moleküle schonender in die Zellen ein als eine Mikroinjektion oder Nanoporation. Die Forscher haben die NFP-vermittelte Elektroporation einzelner HeLa-Zellen mit einer Transfektionseffizienz von mehr als 95 %, einer Lebensfähigkeit von 92 % und einer qualitativen Dosierungskontrolle nachgewiesen.

NFPs stellen eine Verbesserung gegenüber älteren Transfektionstechnologien dar, die Rasterkraftmikroskop-Sonden verwenden. Techniken, die auf der Rasterkraftmikroskopie beruhen, führen häufig dazu, dass Zellen ihre Anhaftung verlieren oder zerreißen. NFP fügt den Zellen weniger Schaden zu.