Elektroakupunktur mildert oxidativen Stress in Leber und Niere bei narkotisierten Ratten

13 -ORIGINALARTIKEL
METABOLISMUS

Elektroakupunktur dämpft den oxidativen Stress in Leber und Niere bei anästhesierten Ratten1

Eletroacupuntura atenua o estresse oxidativo no fígado e no rim em ratos anestesiados

Agamenon Honório SilvaI; Lanese Medeiros FigueiredoI; Paulo Araujo DiasI; Alberico Ximenes do Prado NetoII; Paulo Roberto Leitão de VasconcelosIII; Sérgio Botelho GuimarãesIV

IFellow Master Degree, Department of Surgery, Postgraduate Program, UFC, Ceara, Brasilien. Technische Verfahren, Erfassung und Interpretation der Daten. Der Artikel ist Teil einer Master-Dissertation (AHS)
IIGraduate Student, UFC, Ceara, Brasilien. Mithilfe bei technischen Verfahren, Datenerfassung
IIIPhD, Assistenzprofessor, Koordinator, Postgraduiertenprogramm, Abteilung für Chirurgie, UFC, Ceara, Brasilien. Kritische Überprüfung und Interpretation der Daten
IVPhD, Außerordentlicher Professor, Abteilung für Chirurgie, Leiter, LABCEX, UFC, Ceara, Brasilien. Tutor, Konzeption, Design, intellektueller und wissenschaftlicher Inhalt der Studie, Verfassen des Manuskripts, statistische Analyse

Korrespondenz

ABSTRACT

ZWECK: Untersuchung der Auswirkungen einer einzigen Elektroakupunktursitzung (EA) an den Akupunkten Zusanli (ST-36) und Zhongwan (CV-12) in Kombination bei der Regulierung des oxidativen Stresses in Leber und Niere bei betäubten Ratten.
METHODEN: Achtzehn gesunde Ratten, die nach dem Zufallsprinzip 3 Gruppen (n=6) zugeordnet wurden, wurden intraperitoneal mit Ketamin (90mg kg-1 Körpergewicht) + Xylazin (10mg/kg Körpergewicht) betäubt: G-1: Kontrolle (Anästhesie), G-2: Anästhesie+EA10Hz und 10 mA, 10 Hz) an den rechten ST-36- und CV-12-Akupunkturpunkten für 30 Minuten. G-3 wurde ebenfalls behandelt, allerdings mit einer zehnfach höheren Frequenz (100 Hz). Die G6PDH-Aktivität, Malondialdehyd (MDA) und Glutathion (GSH) wurden spektrophotometrisch bestimmt.
ERGEBNISSE: Die MDA- und GSH-Konzentrationen in der Leber stiegen bei Ratten, die EA 10 Hz (p<0,01) und EA 100 Hz (p<0,001) ausgesetzt waren, im Vergleich zur Kontrolle G-1 signifikant an. Die G6GPH-Aktivität in Leber und Niere nahm bei G-2 (p<0,01) und G-3 (p<0,001) im Vergleich zu G-1 bei EA100Hz-Ratten signifikant ab. Ein ähnliches Muster wurde bei der G6PDH-Aktivität in den Nieren von EA10Hz-Ratten festgestellt.
ZUSAMMENFASSUNG: Eine einzige 30-minütige EA 10/100Hz-Sitzung erhöht die Lipidperoxidation und reduziert gleichzeitig den oxidativen Stress in Leber- und Nierengewebe in einem Rattenmodell.

Schlüsselwörter: Akupunktur. Electroacupuncture. Lipidperoxidation. Oxidative Stress. Rats.

RESUMO

OBJETIVO: Investigar os efeitos de uma única sessão de eletroacupuntura (EA) aplicada nos acupontos Zusanli (E-36) e Zhongwan (RM-12) simultaneamente, na regulação do estresse oxidativo no fígado e rins em ratos anestesiados.
METHODEN: Achtzehn gesunde Ratten, die nach dem Zufallsprinzip in drei Gruppen (n = 6) aufgeteilt wurden, wurden mit Ketamin (90mg/kg Körpergewicht) + Xylazin (10mg/kg Körpergewicht) betäubt: G-1: Kontrolle (Anästhesie), G-2: Anästhesie + EA10Hz und G-3: Anästhesie + EA100Hz. Die Ratten der Gruppe G-2 wurden 30 Minuten lang mit EA (gepulste Rechteckwellen, 10 mA, 10 Hz) an den rechten Akupunkten ST-36 und VC-12 behandelt. Bei den Ratten der Gruppe G-3 wurde eine 10-mal höhere Frequenz (100 Hz) verwendet. Die Aktivität des Enzyms G6PDH und die Konzentrationen von Malondialdehyd (MDA) und Glutathion (GSH) wurden spektrophotometrisch überprüft.
ERGEBNISSE: Die Leberkonzentrationen von MDA und GSH waren bei Ratten, die einer AE mit 10 Hz (p <0,01) und 100 Hz (p <0,001) ausgesetzt waren, im Vergleich zur Kontrolle deutlich erhöht. Die G6GPH-Aktivität war in den Gruppen G-2 (p <0,01) und G-3 (p <0,001) in Leber und Niere im Vergleich zur Gruppe G-1 bei den mit 100 Hz behandelten Ratten signifikant verringert.
ZUSAMMENFASSUNG: Eine einzige 10/100 Hz EA-Sitzung über 30 Minuten erhöht die Lipidperoxidation und reduziert gleichzeitig den oxidativen Stress in Leber und Niere gesunder Ratten.

Deskriptoren: Akupunktur. Elektroakupunktur. Lipidperoxidation. Oxidativer Stress. Ratten.

Einführung

Die manuelle Akupunktur (MA) ist eine der wichtigsten Behandlungsformen der traditionellen chinesischen Medizin. Dabei werden scharfe, dünne Nadeln verwendet, die an ganz bestimmten Punkten (Akupunkturpunkten) in den Körper eingeführt werden. MA wird seit mehreren Jahrtausenden in orientalischen Ländern verwendet und wird auch im Westen zunehmend von Ärzten und Patienten akzeptiert1. Die Elektroakupunktur (EA) ist eine Abwandlung dieser Technik, bei der kleine elektrische Ströme an zuvor in den Körper eingeführte Nadeln angelegt werden, und scheint in vielen spezifischen klinischen und Forschungsumgebungen besser reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen2-4. Die Anwendung von EA auf den Akupunkturpunkt Zusanli (ST-36) reduzierte die Lipidperoxidation in experimentellen Modellen der Ischämie/Reperfusion, z. B. im Rückenmark der Ratte5, im Gehirn6 und im Blutserum7 sowie im Schweineherzmuskel8.

Chakrabarti et al.9 untersuchten die Wirkung einer einmaligen, akuten (7 Impulse/Sek., 0,75 Volt) und chronischen (4 Impulse/Sek., 0,75 Volt) Elektroakupunkturbehandlung an abwechselnden Tagen über einen Zeitraum von 21 Tagen auf die Leberfunktionen von Ratten. Es wurden zwei Rückenakupunkturpunkte und ST-36 verwendet. Nach der chronischen Behandlung sank der Wert der mikrosomalen Lipidperoxidation in der Leber signifikant. Da die manuelle Stimulation des Akupunkturpunktes ST-36 in der Lage ist, die durch Sepsis induzierte Nierenschädigung abzuschwächen10, ist es möglich, dass die elektrische Stimulation dieses Akupunkturpunktes die Konzentrationen von MDA, einem Indikator für Zellmembranschäden, im Nierengewebe verändern kann.

Physiologische Prozesse werden durch Enzyme reguliert. NADPH ist das wichtigste intrazelluläre Reduktionsmittel, und seine Produktion hängt hauptsächlich von der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase ab. Wird die Aktivität der G6PDH gehemmt, kommt es gleichzeitig zu einem Rückgang der NADPH-Aktivität, einem Coenzym, das für den Schutz vor oxidativen Schäden unerlässlich ist. Die Unversehrtheit der Zellen sowie das gesamte antioxidative System hängen von einer ausreichenden Versorgung mit NADPH ab11. In zahlreichen Arbeiten wurde die Wirkung von MA und EA auf den ST-36-Akupunkturpunkt bei der Abschwächung von oxidativem Stress bei verschiedenen experimentellen Erkrankungen nachgewiesen5-9. Darüber hinaus kann die Verwendung von Ketamin und Xylazin, einer häufig in experimentellen Studien verwendeten Narkosemischung, bei gesunden Tieren einen gewissen Grad an oxidativem Stress auslösen12-13.

Es wurde bereits gezeigt, dass große Mengen endogener Opioidpeptide aus den Nebennieren ausgeschüttet werden, wenn CV-12-Akupunkturpunkte mit 2 Hz stimuliert werden14. Bei der Stimulierung des Akupunkturpunkts CV-12 mit einer hochfrequenten EA (15 Hz) wurden mehrere Quellen für endogene Opioidpeptide entdeckt15. Daher wollten wir untersuchen, ob die Anwendung von EA, die sowohl den ST36- als auch den CV-12-Akupunkt stimuliert, mit zwei verschiedenen Frequenzen, 10 Hz und 100 Hz, den MDA- und GSH-Gehalt von Leber und Niere verändern kann und ob es einen Unterschied bei der Lipidperoxidation und dem oxidativen Stress zwischen 10 Hz und 100 Hz EA bei gesunden Nagetieren gibt.

Methoden

Tierpräparation

Männliche Wistar-Ratten mit einem Gewicht von 280-400 g, die von der Kleintierzucht der Medizinischen Fakultät (Bundesuniversität von Ceara) zur Verfügung gestellt wurden, wurden unter kontrollierten Umweltbedingungen gehalten (24°C _relative Luftfeuchtigkeit 40%-60%, 12-stündiger Wechsel von Hell-Dunkel-Zyklen, Futter und Wasser ad libitum). Für die Nadelung und elektrische Stimulation wurden die Äquivalente der rechten ST-36- und CV-12-Akupunkte des Menschen ausgewählt. Die verwendete Akupunkturpunkt-Nomenklatur folgt der WHO-Nomenklatur16. Der ST-36-Akupunkt befindet sich 5 mm unterhalb des Fibulaköpfchens unter dem Kniegelenk und 2 mm seitlich des vorderen Tuberkels des Schienbeins. Die Punktion des ST-36 Akupunkturpunktes stimuliert den Nervus cutaneus lateralis, den kutanen Ast des Nervus saphenus und in der Tiefe den Nervus peroneus17-18. Der Akupunkturpunkt CV-12 befindet sich in der vorderen Mittellinie des Oberbauchs, 20 mm unterhalb der Sternum-Synchondrosis. Diese Region wird durch den vorderen kutanen Ast des 8. Interkostalnervs18 innerviert.

Materialien

Einwegnadeln aus rostfreiem Stahl (0,20×30 mm, 0,5 cm, DongBang Acupuncture Inc., Chung Nam, Korea) wurden verwendet. Der Elektrostimulator EL-608 wurde von NKL Produtos Eletrônicos Ltda. in Brusque, Santa Catarina, Brasilien, erworben.

Versuchsgruppen

Die Tiere wurden intraperitoneal mit einer frisch zubereiteten Mischung aus Ketamin (90mg kg/Körpergewicht) und Xylazin (10mg kg/Körpergewicht) betäubt. Die Ratten wurden nach dem Zufallsprinzip in 3 gleiche Gruppen wie folgt eingeteilt:

* Gruppe 1 (Narkose) – 6 Ratten

* Gruppe 2 (EA 10Hz) – 6 Ratten

* Gruppe 3 (EA 100Hz) – 6 Ratten

Gruppe 1 (Kontrolle) Ratten wurden wie beschrieben narkotisiert. Sechzig Minuten später wurde das Abdomen der Ratten geöffnet und die Leber und die rechte Niere entfernt. Die Ratten der Gruppe 2 (EA10Hz) wurden wie beschrieben betäubt. Nach einer routinemäßigen Hautdesinfektion mit 75 %igem Ethanol wurden sterilisierte Einwegnadeln aus rostfreiem Stahl (0,25 mm × 30 mm) senkrecht und 2-3 mm tief in die rechten Akupunkturpunkte ST-36 und CV-12 eingeführt. An beide Nadeln und an einen Elektrostimulator (NKL EL-608) wurden Elektroden angeschlossen; gepulste Rechteckwellen, 10 Hz, 10 mA wurden 30 Minuten lang angelegt. Die Proben wurden 30 Minuten später entnommen. Die Ratten der Gruppe 3 (EA100Hz) wurden wie die Ratten der Gruppe 2 einer EA unterzogen, jedoch mit einer zehnmal höheren Frequenz (100 Hz).

Biochemische Bestimmungen

Bestimmt wurden u.a. die G6PDH-Aktivität sowie die Konzentrationen von Malondialdehyd (MDA) und Glutathion (GSH). Die Gewebeproben wurden in flüssigem Stickstoff eingefroren und in Glasröhrchen bei -70º gelagert, bis die Leber- und Nierenhomogenate vorbereitet und analysiert wurden. Die Lipidperoxidation wurde durch die Messung von Malondialdehyd als TBA-reaktive Substanz bestimmt19. Dazu wurden dem 10%igen Homogenat (0,5 mL) H3PO4 (1%, 3 mL) und wässrige TBA-Lösung (0,6%, 3 mL) zugesetzt. Das Testmedium wurde geschüttelt und 45 Minuten lang auf einem kochenden Wasserbad erhitzt. Nach dem Abkühlen wurden 4 mL n-Butanol zugegeben und die Mischung geschüttelt. Nach Abtrennung der n-Butanolschicht durch Zentrifugation bei 1200 g für 15 min wurde ihre optische Dichte in einem Spektralphotometer (Beckman DU 640 B; Beckman Instruments, jetzt Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, USA) mit 535 bzw. 520 nm als Absorptionswellenlänge bestimmt. Die Differenz zwischen den Ergebnissen der beiden Bestimmungen der optischen Dichte wurde als TBA-Wert herangezogen, und die Menge an Malondialdehyd (MDA) im Hoden wurde durch Vergleich mit MDA-Standards berechnet und in Mikromol MDA pro Gramm Feuchtgewebe ausgedrückt. Der GSH-Gehalt wurde nach der Methode von Sedlak und Lindsay20 geschätzt, die auf der Reaktion zwischen Thiolgruppen und 5-5-Dithiobis-(2-nitrobenzoesäure) beruht, wobei eine Verbindung entsteht, die Licht bei 412 nm absorbiert. Die GSH-Menge wurde anhand einer Standardkurve bestimmt, die gleichzeitig unter denselben Bedingungen mit verschiedenen GSH-Konzentrationen erstellt wurde. Die G6PDH-Aktivitäten wurden nach den zuvor beschriebenen Methoden geschätzt21. Die Enzymaktivität wurde spektrophotometrisch abgelesen.

Datenanalyse

Graphpad Prism 5.0 (GraphPad Software, San Diego, Kalifornien, USA, www.graphpad.com) wurde für Berechnungen und statistische Analysen verwendet. Alle Ergebnisse wurden als Mittelwert±SD ausgedrückt. Alle Daten wurden auf ihre Verteilung getestet (Kolmorogov-Smirnov-Test mit Dallal-Wilkinson-Lilliefor P-Wert). Zur Bestimmung der Unterschiede zwischen den Gruppen bei den MDA- und GSH-Konzentrationen und der G6PDH-Aktivität in Leber- und Nierengewebe wurde je nach Bedarf eine einseitige ANOVA oder ein Kruskal-Wallis-Test durchgeführt. Bei der Post-hoc-Analyse (Tukey oder Dunn) wurde ein Wahrscheinlichkeitswert von p<0,05 als Hinweis auf statistische Signifikanz angesehen.

Ergebnisse

GSH-Assay

Die GSH-Konzentrationen in der Leber stiegen bei Ratten, die EA 10Hz und EA 100Hz ausgesetzt waren, im Vergleich zur Kontrolle signifikant an (p<0,001) (Abbildung 1). Ein ähnlicher Anstieg der GSH-Konzentrationen in den Nieren trat sowohl in der EA10Hz- als auch in der EA100Hz-Gruppe auf (Abbildung 2). Darüber hinaus stiegen die Leber- und Nieren-GSH-Konzentrationen bei den mit EA100Hz behandelten Ratten im Vergleich zur EA10Hz-Gruppe signifikant an.

MDA-Assay

Die MDA-Konzentrationen in der Leber stiegen bei den Ratten, die EA10Hz (p<0,01) und EA100Hz (p<0,001) erhielten, im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant an (Abbildung 3). Ein ähnlicher Anstieg der MDA-Konzentration in den Nieren trat sowohl in der EA10Hz- als auch in der EA100Hz-Gruppe auf (Abbildung 4). Die MDA-Konzentrationen in der Niere nahmen in der EA100Hz-Gruppe im Vergleich zur EA10Hz-Gruppe signifikant zu.

G6PDH-Assay

Die G6GPH-Aktivität in der Leber nahm in den EA100Hz-Gruppen im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant ab (p<0,001) (Abbildung 5). Ein ähnliches Muster wurde bei der G6PDH-Aktivität in den Nieren der EA10Hz-Ratten festgestellt. Die G6PDH-Aktivität der Niere war in beiden Gruppen nicht unterschiedlich (Abbildung 6).

Diskussion

In unserem Experiment wurde der oxidative Stress durch die Verwendung von Ketamin, einem dissoziativen Anästhetikum, das häufig bei tierärztlichen Eingriffen oder zu Versuchszwecken verwendet wird, ausgelöst. Alva et al.12 wiesen nach, dass Ketamin zu erhöhten plasmatischen Stickoxidwerten führt, eine metabolische Azidose induziert und oxidative Schäden verursacht, ohne jedoch hepatische Toxizität zu erreichen.

Antiperoxidative Wirkungen von Niederfrequenz-EA wurden nachgewiesen. Siu et al.6 stimulierten den Akupunkturpunkt GB-20, der sich auf der hinteren Seite des Halses unterhalb des Hinterhauptbeins in der Vertiefung zwischen dem Musculus sternocleidomastoideus und dem Musculus trapezius befindet, und den ST-36 mit mehreren Anwendungen vor einer zerebralen Ischämie und kamen zu dem Schluss, dass 2 Hz EA die Lipidperoxidation bei zerebraler Ischämie teilweise regulieren kann. GB-20 und ST-36 hatten eine ähnlich positive Wirkung6. In unserer Studie führte die Anwendung von EA zu einem signifikanten Anstieg der MDA-Konzentration in der Leber (Abbildung 3) und in der Niere (Abbildung 4) in den Gruppen EA10Hz und EA100Hz. Ein zusätzlicher Anstieg der Lipidperoxidation trat in der EA100Hz-Gruppe im Vergleich zu den EA10Hz-Ratten auf. Dies deutet darauf hin, dass die Niere anfälliger für Lipidperoxidation ist als die Leber. Es scheint, dass die Anwendung von elektrischer Stimulation mit hohen Frequenzen in einer einzigen Sitzung die Lipidperoxidation in diesem Rattenmodell erhöht.

Yu et al.22 untersuchten die Rolle der Nadelstimulation von vier verschiedenen Akupunkten: GB-34 (Yanglingquan), LR-3 (Taichong), ST-36 (Zusanli) und SP-10 (Xuehai) Akupunkturpunkte auf die Regulierung des oxidativen Stresses im nigrostriatalen System bei der 6-Hydroxydopamin läsionierten Ratte und kamen zu dem Schluss, dass die Akupunkturstimulation die Reduktion des GSH-Spiegels sowie den Anstieg des MDA-Spiegels verhinderte.

Wie wir die Auswirkungen einer einzigen Elektroakupunktursitzung untersuchten, während Yu et al.22 die Auswirkungen der klassischen Akupunkturbehandlung, die 14 Tage lang zweimal täglich durchgeführt wurde, bewertet haben, glauben wir, dass die Anwendung der elektrischen Stimulation in einer einzigen Sitzung für den Anstieg der MDA-Werte verantwortlich sein könnte. Andererseits führte die einmalige Anwendung von EA zu einem signifikanten Anstieg der GSH-Konzentration sowohl im Leber- (Abbildung 1) als auch im Nierengewebe (Abbildung 2). Die schützende Wirkung von EA ist bei höheren Frequenzen größer, wie die erhöhte GSH-Konzentration in der Niere von EA100Hz-Ratten im Vergleich zu EA10Hz-Tieren zeigt.

G6PDH spielt eine sehr wichtige Rolle bei der Zellreaktion auf den oxidativen Stress. Bis vor kurzem herrschte die allgemeine Meinung, dass dieses Enzym nur für menschliche Erythrozyten von Bedeutung ist, die keine anderen NADPH-produzierenden Wege haben23. Jüngste Beobachtungen haben gezeigt, dass die G6PDH eine schützende Rolle gegen reaktive Sauerstoffspezies in eukaryontischen Zellen spielt, die über alternative Wege für die Produktion von NADPH verfügen24. In dieser Studie nahm die G6PDH-Aktivität in der Leber der EA10Hz- und EA100Hz-Gruppen deutlich ab. Ein ähnlicher Rückgang der Aktivität wurde in der Niere von EA10Hz-Ratten beobachtet. Die GSH-Konzentrationen in den Nieren von EA100Hz-Ratten stiegen an, während gleichzeitig ein Rückgang der G6PDH-Aktivität in derselben Gruppe festgestellt wurde.

Yu et al.25 haben anhand von Zellsuspensionskulturen von Taxus chinensis nachgewiesen, dass die G6PDH-Aktivierung umgekehrt mit den intrazellulären GSH-Konzentrationen korreliert ist. Es ist möglich, dass tierische Zellen ein ähnliches Verhalten zeigen.

Was die Stärken und Schwächen dieser Studie im Vergleich zu anderen betrifft, so gibt es keine veröffentlichte Studie, die direkt mit der vorliegenden Untersuchung verglichen werden kann. Trotz der Tatsache, dass hier peroxidative Wirkungen von EA nachgewiesen wurden, wurde im Gegensatz zu anderen Studien6 die 10-Hz-Elektrostimulation von anderen Forschern nicht verwendet. In den veröffentlichten Studien wurde niederfrequente EA (2 Hz) in mehreren Sitzungen verwendet. In unserer Studie wurde eine einzige Sitzung verwendet. Der Rückgang der G6PDH-Aktivität in Leber und Niere von Ratten, die mit 100 Hz bzw. 10 Hz behandelt wurden, und der gleichzeitige Anstieg des GSH-Spiegels nach einer einzigen EA-Sitzung deuten darauf hin, dass höhere Frequenzen einen besseren Schutz vor oxidativem Stress bewirken könnten. Die beteiligten Mechanismen sind bisher noch nicht klar. Weitere Studien könnten ein neues Licht auf die schützenden Wirkungen der Elektroakupunktur werfen.

Schlussfolgerung

Die gesammelten Daten unterstützen die Hypothese, dass eine einzige 30-minütige EA 10/100Hz-Sitzung die Lipidperoxidation verbessert und gleichzeitig den oxidativen Stress durch Erhöhung des GSH-Spiegels in Leber- und Nierengewebe in einem Rattenmodell reduziert.

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