Ein universelles Heparin-Antidot mit vernachlässigbarer Wirkung auf die Fibrin(ogen)- und Plasmagerinnung

Hintergrund und Ziel

Antikoagulanzien spielen eine zentrale Rolle bei der Behandlung thromboembolischer Erkrankungen. Blutungen bei chirurgischen Patienten, die Antikoagulanzien erhalten, sind ein großes Problem. Antidote werden verabreicht, um der Antikoagulation entgegenzuwirken und die normale Hämostase wiederherzustellen. Bislang ist Protaminsulfat (PS), ein kationisches Polypeptid, das einzige klinisch zugelassene Gegenmittel für unfraktioniertes Heparin. PS hat toxische Nebenwirkungen und Einschränkungen. Die Unfähigkeit von PS, niedermolekulare Heparine und Fondaparinux vollständig umzukehren, ist auf seine geringe Bindungsaffinität zu diesen Arzneimitteln zurückzuführen. PS interagiert jedoch mit Gerinnungsproteinen wie Fibrinogen und bildet Aggregate, was zu kardiovaskulären Nebenwirkungen führt. Vor kurzem haben wir ein synthetisches universelles Heparin-Umkehrmittel (UHRA) mit hoher Bindungsaffinität zu Heparinen entwickelt. In-vivo-Studien ergaben, dass UHRA die Wirkung aller klinisch verfügbaren parenteralen Antikoagulanzien vollständig aufhebt und nicht toxisch ist. In dieser Studie soll die Ungiftigkeit von UHRA durch die Bewertung seines Einflusses auf Fibrinogen, Fibringerinnselarchitektur, Plasmagerinnung und Gerinnselauflösung nachgewiesen werden.

Methoden

UHRA wurde entwickelt, indem tertiäre Amin-basierte Heparin-Bindungsgruppen in ein dendritisches, hyperverzweigtes Polyglycerin-Gerüst eingebaut und mit Methoxy-Polyethylenglykol-Ketten verschlossen wurden. Um die Auswirkungen von UHRA auf das Gerinnungssystem zu verstehen, wurden Rekalzifizierungs- und Gewebefaktor (TF)-initiierte turbidimetrische Plasmagerinnungstests durchgeführt. Die Wechselwirkung von UHRA auf Fibrinogen wurde mit Hilfe eines Fibrinogen-Aggregationstests, eines Fibrinpolymerisationstests und einer spektroskopischen Analyse (Fluoreszenz und Zirkulardichroismus (CD)) untersucht. Der Einfluss von UHRA auf die Architektur des Fibringerinnsels wurde mit Hilfe der Rasterelektronenmikroskopie (REM) untersucht. Die Neutralisierung von Antikoagulantien (Heparine) durch UHRA wurde mit Hilfe eines fluorogenen Thrombin-Generierungstests (TGA) in menschlichem plättchenreichem Plasma (PRP) untersucht. Die Lyse von TF-induzierten Plasmagerinnseln, die UHRA oder PS enthielten und exogenem Gewebeplasminogenaktivator (t-PA) ausgesetzt waren, wurde mit einem turbidimetrischen Assay untersucht.

Ergebnisse und Diskussion

Die Ergebnisse der Plasmagerinnungstests zeigten, dass UHRA die Gerinnungsparameter im Vergleich zu PS nicht veränderte (TF-induzierte Verzögerungszeit und maximale Absorption, Kontrolle vs. UHRA 200 mcg/mL, p=0.21 bzw. 0,16; Verzögerungszeit und maximale Absorption bei der Rekalzifizierung, Kontrolle vs. UHRA 200mcg/mL, p=0,08 bzw. 0,13), was darauf hindeutet, dass UHRA bei der untersuchten Konzentration keine Auswirkungen auf das Gerinnungssystem hat (Abbildung 1). Im Gegensatz zu Protamin wurde der Fibrinogenaggregations- und Fibrinpolymerisationstest durch UHRA in einem breiten Konzentrationsbereich von 0,05 mg/ml bis 1 mg/ml nicht beeinflusst. Zusammen mit Tryptophan-Fluoreszenzlöschungsmessungen (Abbildung 2) und Fibrinogen-Sekundärstrukturmessungen wird bestätigt, dass UHRA nicht mit Fibrinogen interagiert. Die Ergebnisse unterscheiden sich deutlich von PS und anderen synthetischen kationischen Polymeren, die mit Fibrinogen interagieren und Aggregation und Konformationsänderungen hervorrufen. Fibringerinnsel, die in Gegenwart von UHRA (selbst bei 0,5 mg/mL) gebildet wurden, zeigten eine ähnliche Struktur und Fasergröße wie normale Fibringerinnsel (Kontrolle vs. UHRA 0,5 mg/mL Gerinnsel, p= 0,12) (Abbildung 3). Bei Fibringerinnseln, die in Gegenwart von 0,05 mg/ml PS (klinische Dosis) gebildet wurden, nahm die Fasergröße hingegen zu und die Gerinnselstruktur veränderte sich drastisch (Kontrolle vs. PS 0,05 mg/ml Gerinnsel, p< 0,0001). Unsere Studien zur Lyse von Blutgerinnseln in Gegenwart von exogenem t-PA zeigen, dass UHRA den Abbau von Blutgerinnseln im Gegensatz zu Protamin nicht verstärkt. UHRA stellte die Thrombinwerte in antikoaguliertem (heparinisiertem) PRP wieder her, was die Wirksamkeit beweist.

Schlussfolgerung und Bedeutung

Unsere Studien zeigen, dass das universelle Heparin-Antidot UHRA vernachlässigbare Auswirkungen auf Fibrinogen, Fibrinpolymerisation, Gerinnselstruktur, Gerinnselabbau und das Gerinnungssystem hat, was ihre ausgezeichnete Hämokompatibilität im Vergleich zu Protamin zeigt. Unsere Ergebnisse unterstützen die Tatsache, dass UHRA ein ideales Antidot zur Wiederherstellung der Hämostase nach invasiven chirurgischen Eingriffen und zur Behandlung von Blutungskomplikationen durch heparinbasierte Antikoagulanzien sein könnte.

Es sind keine relevanten Interessenkonflikte zu melden.