Echovirus 4 assoziiert mit der Hand-, Fuß- und Mundkrankheit

VIROLOGIE

Echovirus 4 assoziiert mit der Hand-, Fuß- und Mundkrankheit

Echovirus 4 assoziiert mit der Hand-, Fuß- und Mundkrankheit

Denise Hage Russo; Adriana Luchs; Bráulio Caetano Machado; Rita de Cássia Carmona; Maria do Carmo Sampaio Timenetsky

Enteric Viruses Laboratory, Adolfo Lutz Institute, São Paulo, SP, Brasilien

Korrespondenz an

Zusammenfassung

Die Hand-Fuß-Mund-Krankheit (HFMD) ist eine ansteckende enterovirale Infektion, die vor allem bei Kindern auftritt und durch vesikuläre palmoplantare Eruptionen und erosive Stomatitis gekennzeichnet ist. Das Echovirus 4 (EV-4) wurde häufig mit aseptischer Meningitis in Verbindung gebracht. Über einen Zusammenhang zwischen HFMD und EV-4 wurde bisher noch nicht berichtet. Zwei Proben eines 14 Monate alten Kindes, das leichtes Fieber, wunde Stellen im Mund und einen Ausschlag mit Blasen an den Handflächen und Fußsohlen aufwies, wurden an das Labor für enterische Viren des Adolfo-Lutz-Instituts geschickt. Die klinischen Proben wurden in drei verschiedene Zelllinien beimpft, und die Proben, die einen zytopathischen Effekt (CPE) aufwiesen, wurden einem indirekten Immunfluoreszenztest (IFA) und einer „Ein-Schritt“-RT-PCR unterzogen. Die Agarosegel-Elektrophorese des RT-PCR-Produkts ergab ein Produkt mit 437 bp, das für die Enterovirus-Gruppe charakteristisch ist. Echovirus 4 wurde durch IFA identifiziert. Obwohl HFMD eine Virusinfektion ist, die hauptsächlich mit Enterovirus 71 (HEV-71) und Coxsackievirus A16 (CV-A16) assoziiert ist, zeigen unsere Ergebnisse eine Vielfalt von Serotypen im Zusammenhang mit HFMD und unterstreichen die Bedeutung der epidemiologischen Überwachung dieser Krankheit und ihrer Komplikationen.

Schlüsselwörter: Hand-Fuß-Mund-Krankheit; Enterovirus; Echovirus.

RESUMO

A Doença de Mão, Pé e Boca (DMPB) é uma infecção enteroviral contagiosa que ocorre principalmente em crianças sendo caracterizada por erupções palmoplantares vesiculares e estomatite. Das Echovirus 4 (EV-4) ist häufig mit der Meningitis asséptica assoziiert. Die Assoziation von DMPB durch EV-4 wurde bisher noch nicht beschrieben. Zwei Proben eines 14 Monate alten Kindes mit Fieber, Rachensekret und Ausschlag an Hand- und Fußflächen wurden an das Labor für Enterische Viren des Instituto Adolfo Lutz geschickt. Die Proben wurden in drei verschiedene Zelllinien beimpft; diejenigen, die einen zytopathischen Effekt (CPE) aufwiesen, wurden einem indirekten Immunfluoreszenztest (IFI) und einer „Ein-Schritt“-RT-PCR unterzogen. Die mit dem PCR-Produkt durchgeführte Agarosegel-Elektrophorese ergab ein Produkt von 437pb, das für die Enterovirus-Gruppe charakteristisch ist. Der Serotyp EV-4 wurde durch IFI identifiziert. Obwohl es sich bei DMPB um eine Virusinfektion handelt, die hauptsächlich mit dem Enterovirus 71 (HEV-71) und dem Coxsackievirus A16 (CV-A16) in Verbindung gebracht wird, unterstreichen unsere Ergebnisse die Notwendigkeit von epidemiologischen und Laborstudien, die EV-4 als Erreger von DMPB ins Visier nehmen.

EINFÜHRUNG

Die Hand-Fuß-Mund-Krankheit (HFMD) ist eine häufige Erkrankung von Säuglingen und Kindern unter 10 Jahren und zeichnet sich durch Fieber, wunde Stellen im Mund und Ausschlag mit Blasen aus. HFMD beginnt mit leichtem Fieber, Appetitlosigkeit, Unwohlsein und häufig mit Halsschmerzen. Ein oder zwei Tage später werden Fieber und die Entwicklung von Wunden im Mund beobachtet. Häufig treten kleine rote Flecken mit Bläschen auf, die zu Geschwüren werden. Sie befinden sich in der Regel auf der Zunge, dem Zahnfleisch und der Innenseite der Wangen. Der Hautausschlag entwickelt sich über 1-2 Tage mit flachen oder erhabenen roten Flecken, teilweise mit Blasen. Der Ausschlag juckt nicht und tritt in der Regel an den Handflächen und Fußsohlen auf. Er tritt auch auf dem Gesäß auf. Manche Personen mit HFMD haben jedoch nur Ausschlag oder Mundgeschwüre4.

Die Übertragung erfolgt von Mensch zu Mensch durch direkten Kontakt mit Ausscheidungen aus Nase und Rachen oder durch fäkal-orale Wege. HFMD wird nicht auf oder von Haustieren oder anderen Tieren übertragen. Einzelne Fälle von HFMD treten weltweit auf, am häufigsten im Sommer und Frühherbst4. Es kommt auch zu einer vertikalen Übertragung von der Mutter auf den Fötus, doch verlaufen die Fälle ohne langfristige Komplikationen, während eine Infektion im ersten Trimester zu einem Spontanabort oder einer intrauterinen Wachstumsverzögerung führen kann. Es wurden weitere Komplikationen gemeldet, darunter Myokarditis, Meningoenzephalitis, Lungenödem und sogar Tod16.

Der erste Bericht über HFMD stammt von ROBINSON & RHODES im Jahr 195812. Sie berichteten über ein Exanthem mit Fieber und oralen Läsionen, das bei über 60 Personen im Juni und Juli 1957 in Toronto, Kanada, festgestellt wurde. Das Coxsackievirus A16 (CV-A16) wurde aus zwei Dritteln der 27 untersuchten Stuhlproben isoliert. Die nächste gemeldete Coxsackievirus-Epidemie ereignete sich im Sommer 1960 in Birmingham, England, und wurde von ALSOP et al.2 beschrieben, die vesikuläre Läsionen an Händen und Füßen mit oropharyngealen Läsionen feststellten und die Eruption als Hand-Fuß-Mund-Krankheit bezeichneten16.

HFMD wird durch Enteroviren verursacht, die zur Familie der Picornaviren gehören (einzelsträngige RNA, nicht umhüllt), und ist am häufigsten mit CV-A16 oder Enterovirus 71 (HEV-71) assoziiert. Sporadische Fälle, die mit CV-A4 bis CV-A7, CV-A9, CV-A10, CV-B1 bis CV-B3 und CV-B5 assoziiert sind, wurden ebenfalls gemeldet. Die Infektionen treten in der Regel sporadisch auf, aber es gibt auch regelmäßig Epidemien. Die virale Infektion beginnt in der Wangen- und Darmschleimhaut und breitet sich innerhalb von 24 Stunden auf die regionalen Lymphknoten aus. Die Virämie folgt rasch und das Virus breitet sich auf die Mundschleimhaut und die Haut aus. Etwa am 7. Tag nach der Infektion können die Antikörperspiegel im Serum ansteigen 6,8.

PATIENTEN UND METHODEN

Proben: Im Juli 2003 kam es in einer Kindertagesstätte in São Paulo City zu einem HFMD-Ausbruch, und zwei Stuhlproben eines 14 Monate alten männlichen Kindes mit Verdacht auf HFMD wurden an das Labor für enterische Viren des Adolfo-Lutz-Instituts geschickt. Das Kind hatte Fieber, wunde Stellen im Mund, Unwohlsein, Appetitlosigkeit und Ausschlag an den Handflächen und Fußsohlen. Andere acht Kinder desselben Zentrums im Alter von 10 Monaten bis drei Jahren wiesen ähnliche Symptome auf. HFMD wurde von anderen medizinischen Zentren diagnostiziert (persönliche Mitteilung). Es war nicht möglich, gepaarte Serumproben zu sammeln, um die serologischen Tests zur Antikörpertitration durchzuführen.

Virale Isolierung und Identifizierung: Proben, die innerhalb von sechs Tagen nach dem Schoß gesammelt wurden, wurden durch Zentrifugation bei 10.000 x g/60 Minuten bei 4 ºC geklärt; Antibiotika (Streptomycin und Penicillin) wurden hinzugefügt und der Überstand wurde bei -70 ºC bis zur Inokulation (0,1 und 0,2 ml/Röhrchen) auf drei verschiedenen Zelllinien gelagert: RD (humanes Rhabdomyosarkom), HEp 2 (humanes epidermales Larynxkarzinom) und Vero (grüne Affenniere) mit minimalem essentiellem Medium (Eagle’s L15, Eagle’s + AANE + Piruvate bzw. 199 Medium). Danach wurden die Röhrchen bei 35-37 ºC aufbewahrt. Die Kulturen wurden täglich unter dem Inversionsmikroskop beobachtet, um den zytopathischen Effekt (CPE) sichtbar zu machen. Das inokulierte Material wurde so lange wiederholt, bis der charakteristische CPE einer HEV-Infektion auftrat oder nicht7.

Indirekter Immunfluoreszenztest – IFA: Wenn die Zellkultur mindestens 75 % CPE aufwies, wurde sie aus dem Röhrchen geschabt und die Zellsuspension auf einen Objektträger getupft, der an der Luft getrocknet und mit Aceton fixiert wurde. Anschließend wurde ein indirekter Immunfluoreszenztest (IFA) mit spezifischen monoklonalen Antikörpern durchgeführt, die im Handel erhältlich sind (Chemicon International Inc., Temecula, CA/USA) und Gattung, Gruppe und HEV-Serotypen abdecken. Die Vertiefungen der Objektträger wurden unter einem Epifluoreszenzmikroskop3 untersucht.

RT-PCR: Die virale RNA wurde aus dem Virusisolat mit Trizol® LS (Invitrogen, Kat. 1296-010) und Chloroform nach den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Nach Zentrifugation bei 12.000 xg wurde die wässrige Phase abgetrennt und mit Isopropylalkohol ausgefällt. Das RNA-Pellet wurde mit 75 % Ethanol gewaschen. Am Ende des Verfahrens wurde die RNA kurz getrocknet und mit Milli-Q-Wasser resuspendiert; RNAsin wurde hinzugefügt und die RNA bei -70 ºC gelagert. Die cDNA wurde unter Verwendung der extrahierten RNA und der Mischung synthetisiert: 50 mM MgCl2; 10x PCR-Puffer; 1,25 nM dNTP; 20 µM/µL Primer AS1/S1; 2 µL Super Script II RNAse Reverse Transcriptase; 2,5 U/µL TaqQ DNA Polymerase; 40 U/µL RNAsin und Milli-Q Wasser. Die Amplifikationsreaktionen wurden im Gene Amp PCR System 9600 Perkin Elmer Thermocycler mit der folgenden Programmierung durchgeführt: (42 ºC/1h) + (95 ºC/5 min) + 25 Zyklen (94 ºC/1 min + 50 ºC/2 min + 72 ºC/1min) + (72 ºC/7min). Die PCR-Produkte wurden mit einem 1,5%igen Agarosegel aufgetrennt, mit Ethidiumbromid gefärbt und unter UV-Licht sichtbar gemacht. Die auf die 5′-nicht-translatierte Region gerichteten Primer amplifizierten ein Produkt von 437bp13.

ERGEBNISSE

CPE, die auf HEV hinweisen: Rundung, Schrumpfung, Kernpyknose, Refraktilität und Zelldegeneration waren empfindlich gegenüber RD- und Vero-Zellen. Die Zeit bis zur Meldung positiver Kulturen betrug etwa 4-7 Tage.

Unter dem Epifluoreszenzmikroskop konnte bei 400x eine helle apfelgrüne Fluoreszenz im Zellkern und/oder im Zytoplasma der Zellen beobachtet werden, was auf eine positive Reaktion auf den Serotyp des Echovirus 4 hinweist. IFA war negativ auf die anderen monoklonalen Antikörper.

Zur Bestätigung der HEV-Gattung wurde eine RT-PCR durchgeführt. Die Agarosegel-Elektrophorese zeigte ein Produkt mit 437 bp, das HEV identifizierte (Abb. 1).

DISKUSSION

Der in dieser Studie identifizierte ätiologische Erreger ist ein HEV, das sich von den anderen bisher mit HFMD in Verbindung gebrachten unterscheidet. Dieses Syndrom wurde häufig mit CV-A16 und HEV-71 in Verbindung gebracht, während in der Literatur keine epidemiologischen Daten über EV-4 in Verbindung mit HFMD gefunden wurden.

Der HFMD-Ausbruch in Malaysia (1997) wurde hingegen mit EV-1, CV-A9 und HEV-711 in Verbindung gebracht. HFMD, verursacht durch HEV-71, wurde mit tödlichen Fällen von Enzephalitis während der Ausbrüche in Malaysia (1997) und Taiwan (1998) in Verbindung gebracht17. In der zweiten Hälfte des Jahres 2000 wurde neben CV-A16 und EV-7 auch EV-7 als ätiologischer Erreger der HFMD entdeckt5. In Brasilien berichteten MOREIRA et al. (1995) über eine epidemische exanthematische Erkrankung, die mit dem Coxsackievirus B3 (CV-B3) in Verbindung gebracht wurde10. In Brasilien gibt es keinen Bericht über einen Zusammenhang mit EV-4 und HFMD, was möglicherweise auf den fehlenden klinischen Verdacht zurückzuführen ist.

Das EV-4 wird im Allgemeinen mit aseptischer Meningitis, Enzephalitis, Lähmungen, Güillan-Barré-Syndrom, Exanthem und Atemwegserkrankungen in Verbindung gebracht und wurde weltweit gefunden, hauptsächlich als Ursache für Ausbrüche aseptischer Meningitis: in Kuba von 1972 bis 1999, in Kapstadt, Südafrika von 1981 bis 1989, im April 1997 in Regionen Israels und der Palästinensischen Autonomiebehörde, in Spanien von 1988 bis 2003, im Herbst 1982 in Polen und in Vellore und Umgebung in Indien im Jahr 20028,9,11,14,15,18.

Typischerweise verlaufen Enterovirus-Infektionen entweder asymptomatisch oder führen zu einer leichten Erkrankung. Es wird daher empfohlen, Serumproben zu entnehmen, um eine Antikörpertitration mittels Mikroneutralisationstechnik durchzuführen, was ein weiterer Parameter wäre, um zu bestätigen, dass das isolierte Virus für die Krankheit verantwortlich ist. In Verbindung mit der Stuhlisolierung bestätigt der Anstieg der Serumtitration um das Vierfache (Serokonversion) die akute Infektion. Leider war es in dieser Studie nicht möglich, Serumproben zu erhalten.

Trotzdem wurde bei allen anderen acht Kindern von den medizinischen Zentren aufgrund der klinischen Anzeichen die Diagnose HFMD gestellt.

Auch wenn dieses Ergebnis nicht ausreicht, um zu behaupten, dass EV-4 eine Ursache für die Krankheit ist, scheint es vernünftig zu sein, zu schließen, dass die Signale und offensichtlichen klinischen Manifestationen die Hypothese bestätigen, dass das Virus nicht übertragbar ist.

Es ist wichtig zu betonen, dass CV-A16 und HEV-71, die als Hauptverursacher von HFMD bekannt sind, in der Regel CPE in RD-, HEp2- und Vero-Zellkulturen produzieren; in dieser Studie wurden sie jedoch nicht identifiziert.

Unsere Arbeit zeigt EV-4 als ursächlichen Erreger von HFMD und legt die Möglichkeit nahe, dass andere HEV-Serotypen möglicherweise mit HFMD-Fällen in Verbindung gebracht werden könnten. Dieser Fallbericht unterstreicht die Notwendigkeit, epidemiologische und labortechnische Studien zu diesem Serotyp zu intensivieren, und die Überwachung anderer HEV-Serotypen, die an HFMD beteiligt sind, muss in Brasilien verstärkt werden.

HINWEISE

Wir danken insbesondere Dr. Luís Florêncio Salles Gomes für seine Anregungen und Kritik zu diesem Artikel.

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