Dephosphorylierung

V.B Protein Phosphatases in RPTK Signaling

Die Tyrosin-Deposphorylierung ist ein weiterer schnell wirkender Mechanismus zur Hemmung oder Beendigung der Signalübertragung durch RPTKs. Die Proteinphosphorylierung bei der Signaltransduktion ist reversibel, und die PTKs wirken mit den PTPasen zusammen, indem sie die Einleitung, das Ausmaß und die Beendigung der Tyrosinphosphorylierung bestimmen. Die Herabregulierung der RPTK-Signalübertragung erfolgt nicht nur durch direkte Phosphotyrosin-Deposphorylierung des RPTK selbst (d. h., das RPTK ist ein Substrat für die PTPase), sondern auch durch Dephosphorylierung eines wichtigen nachgeschalteten Ziels des RPTK. Da Tyrosin-phosphorylierte Proteine, Serin- und Threonin-phosphorylierte Proteine und sogar Phospholipide Vermittler von RPTK-Signalen sind, gibt es Beispiele für Protein-Serin/Threonin-spezifische Phosphatasen und Phosphoinositid-spezifische Lipidphosphatasen, die ebenfalls die Herunterregulierung von RPTK-vermittelten Signalen vermitteln. Es folgen einige Beispiele sowie eine kurze, allgemeine Beschreibung der Proteinphosphatasen.

Alle identifizierten PTPasen enthalten eine konservierte, ∼280 Aminosäuren lange PTPase-Domäne. Ihre spezifische katalytische Aktivität ist etwa 1000-mal höher und viel weniger spezifisch als die der PTKs. Wie bei den PTKs lassen sich auch die PTPasen in transmembranäre und zytoplasmatische PTPasen unterteilen. Transmembran-PTPasen enthalten extrazelluläre Regionen mit Motiven wie Fibronektin Typ III-ähnliche Wiederholungen, Cadherin-ähnliche Wiederholungen und Immunglobulin-ähnliche Domänen. Sie haben eine einzige transmembranüberspannende Region, auf die in der Regel zwei PTPase-Domänen folgen, von denen nur eine katalytische Aktivität zu haben scheint. Wie ihre extrazelluläre Region vermuten lässt, sind bestimmte Transmembran-PTPasen, wie PTPκ und PTPμ, an der homophilen Zell-Zell-Adhäsion beteiligt, und PTPμ kann Zell-Zell-Kontakte durch Dephosphorylierung von Cateninen und Cadherinen stabilisieren. Diese und andere Transmembran-PTPasen wurden nicht mit der direkten Dephosphorylierung von RPTKs in Verbindung gebracht, im Gegensatz zu den zytoplasmatischen PTPasen, von denen mehrere in der Lage sind, RPTKs direkt zu dephosphorylieren.

Die hämatopoetisch exprimierte, zytoplasmatische Protein-Tyrosin-Phosphatase SHP-1 ist eine von nur zwei identifizierten SH2-Domänen-enthaltenden PTPasen. SHP-1 bindet an aktivierte RPTKs, wie CSF-1 und Kit/SCF-Rezeptor, über eine seiner beiden SH2-Domänen. Die SH2-Bindung von SHP-1 und der strukturell verwandten SHP-2 (siehe unten) hebt eine autoinhibitorische Beschränkung der PTPase-Domäne auf. Dementsprechend wurde gezeigt, dass sowohl die CSF-1- als auch die Kit/SCF-Rezeptoren direkte Substrate für SHP-1 sind und dass SHP-1 für die normale Herunterregulierung der Kit- und CSF-1-Rezeptor-Signalgebung wichtig ist. Dies hat auch physiologische Bedeutung. So weisen Mäuse mit dem Motheaten (me)-Phänotyp, der auf natürlich vorkommende Loss-of-Function (LOF)-Mutationen in SHP-1 zurückzuführen ist, zahlreiche hämatopoetische Anomalien auf, die auf eine Hyperproliferation von myeloischen/monozytären und Mastzellen zurückzuführen sind. Es wird angenommen, dass die deregulierte CSF-1- und Kit-Rezeptor-Signalübertragung diese Defekte verursacht, was durch Studien gestützt wird, die zeigen, dass der Phänotyp der dominanten White-Spotting (W)-Mäuse, die natürlich vorkommende LOF-Mutationen in Kit aufweisen, durch Kreuzung mit den me-Mutanten-Mäusen gemildert wird und umgekehrt. Diese und neuere Daten, die alternative Transkripte zeigen, die entweder Trunkierungen von SHP-1 oder Frameshift-Mutationen verursachen, die zum Verlust von SHP-1 in primären Kit-exprimierenden Tumorzelllinien von Leukämiepatienten führen, deuten darauf hin, dass SHP-1 ein Tumorsuppressor ist.

Die Protein-Tyrosin-Phosphatase PTP1B ist eine weitere zytosolische Phosphatase, die an der direkten Herunterregulierung der RPTK-Signalübertragung beteiligt ist. PTP1B bindet über ihre N-terminale katalytische Domäne über einen unbekannten Mechanismus an die aktivierten Insulin- und IGF-1-Rezeptoren. Nach der Bindung dephosphoryliert PTP1B direkt den Insulinrezeptor selbst und sein wichtigstes assoziiertes Andockprotein, Insulinrezeptorsubstrat-1 (IRS-1). Dementsprechend führt die gezielte Deletion von PTP1B in Mäusen zu einer Hyperphosphorylierung von Insulinrezeptor und IRS-1 und zu einer Sensibilisierung der Insulinsignalisierung. PTP1B dephosphoryliert auch STAT5a und STAT5b und verhindert dadurch deren Kerntranslokation und Transkriptionsaktivität. STAT5a und STAT5b werden von JAKs phosphoryliert, die durch Zytokinrezeptoren aktiviert werden, aber auch direkt von mehreren RPTKs.

PTP1B sowie die rezeptorähnliche PTPα und SHP-2, eine weitere SH2-Domäne-enthaltende Phosphatase, sind jedoch auch an der Verstärkung der Signalübertragung stromabwärts von RPTKs beteiligt. PTP1B wird in Brustkrebszelllinien überexprimiert, wo es eine Dephosphorylierung von Tyr527 am C-Terminus von c-Src bewirkt. Dies führt zu einer verstärkten Src-Kinase-Aktivität, da die Phosphorylierung dieser Stelle die Src-Aktivität durch einen allosterischen, autoinhibitorischen Mechanismus hemmt. Das transmembrane RPTPα wird in vivo an Tyr789 tyrosinphosphoryliert, wodurch eine Bindungsstelle für c-Src entsteht, die es RPTPα ermöglicht, Tyr527 in Src in vitro zu dephosphorylieren. Interessanterweise sind sowohl die Bindung als auch die Dephosphorylierung von Src von der Phosphorylierung an Tyr789 abhängig, und für die Aktivierung von Src durch RPTPα wurde ein Phosphotyrosin-Verdrängungsmechanismus vorgeschlagen. Dementsprechend heben Kinase-defekte oder Tyr789Phe-Mutanten von RPTPα die neoplastische Transformation durch überexprimiertes RPTPα auf, und die gezielte Unterbrechung von RPTPα führt zu einer verringerten Aktivität von Mitgliedern der Src-Familie in Zellen der mutierten Mäuse, die mit erhöhten Phosphorylierungswerten von Tyr527 korreliert. SHP-2, das ubiquitär exprimiert wird, assoziiert in vivo über seine SH2-Domänen mit zahlreichen RPTKs und PTK-Substraten, darunter die Rezeptoren für PDGF, EGF, insulinähnlichen Wachstumsfaktor-1 (IGF-1) und SCF sowie das Andockprotein IRS-1. SHP-2 wird als Reaktion auf die Stimulation mit verschiedenen Wachstumsfaktoren tyrosinphosphoryliert, und tyrosinphosphoryliertes SHP-2 bindet an die Rezeptoren für PDGF oder SCF sowie an das Adaptormolekül Grb2. Das gebundene SHP-2 wiederum dephosphoryliert nachweislich selektiv Tyrosinreste im PDGFR-β, die für die Bindung von PI 3′-Kinase und dem GAP für Ras wichtig sind. Außerdem hemmt die Mikroinjektion von blockierenden Antikörpern gegen SHP-2 oder die Expression von SHP-2 SH2-Domänen oder von katalytisch inaktivem SHP-2 die durch EGF, Insulin und IGF-1 stimulierte Mitogenese. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass SHP-2 ein Upstream-Aktivator der Ras-Signalisierung und anderer Grb2-regulierter Signalwege ist und möglicherweise ein Modulator der RPTK-induzierten PI 3′-Kinase-Signalisierung ist. Ähnlich wie bei SHP-1 könnte die Bindung von SHP-2 dessen katalytische Funktion aktivieren. SHP-2 soll auch Tyr527 im C-Terminus von Src dephosphorylieren, was eine zusätzliche positive Regulierung der Signalübertragung bewirkt.

Sehr viele Serin/Threonin-Proteinkinasen und ihre Substrate werden von der großen serin/threoninspezifischen Phosphatase PP2A dephosphoryliert. Dabei handelt es sich um eine zytoplasmatische und nukleäre heterotrimere Phosphatase, die aus einer strukturellen A-Untereinheit, einer regulatorischen B-Untereinheit und einer katalytischen C-Untereinheit besteht. PP2A ist über seine regulatorische Untereinheit an zahlreiche Gerüstproteine gebunden, und seine Aktivität wird im Kontext der zusammengesetzten Gerüste streng reguliert. Eines der wichtigsten Substrate in der RPTK-Signalgebung ist das PI 3′-Kinase-Ziel Akt, eine Protein-Serin/Threonin-Kinase, die das Zellüberleben zum Teil durch Phosphorylierung des Bcl-2-Familienmitglieds Bad vermittelt. PP2A dephosphoryliert die aktivierende Phosphorylierungsstelle T308 in Akt, die für die Kinaseaktivität entscheidend ist. Darüber hinaus könnte PP2A das antiapoptotische Molekül Bcl-2 dephosphorylieren und damit dessen Überlebensfunktion aufheben. Es wurden zahlreiche weitere Substrate für PP2A identifiziert, von denen viele wichtige nachgeschaltete Ziele von RPTKs sind.

Zwei Phosphoinositid-spezifische Phosphatasen, PTEN bzw. SHIP1/2, dephosphorylieren spezifisch die D-3- und die D-5-Position des Inositolrings in PtdIns(3,4,5)P3, einem der Haupteffektoren der PI 3′-Kinase-Signalgebung. Dies wirkt der RPTK-initiierten PI 3′-Kinase-Signalisierung entgegen, und dementsprechend hat sich PTEN als ein häufig mutiertes menschliches Tumorsuppressor-Gen erwiesen. Inaktivierende Mutationen in PTEN sind maßgeblich an bestimmten neuronalen, Brust- und Keimzelltumoren beim Menschen beteiligt, was mit einer erhöhten Aktivität von Akt verbunden ist.