Articles /

U.S. Food and Drug Administration

Bacteriologisk analytisk håndbog (BAM) Main Page

Autorer: Sandra M. Tallent, Reginald W. Bennett og Jennifer M. Hait

Revisionshistorik:

  • juni 2017 – Nyt kapitel 13B blev tilføjet til Bacteriological Analytical Manual
  • januar 2018 – Hyperlink til CDC APHIS/CDC Form 4 rettet

Stafylokokker-fødevareforgiftning (SFP) er en forgiftning som følge af indtagelse af fødevarer, der er forurenet med tilstrækkelige niveauer af præformede enterotoxiner. Symptomerne på SFP viser sig inden for 2-8 timer efter indtagelse og omfatter kvalme, opkastning, kramper i maven med eller uden diarré, som typisk forsvinder inden for 24-48 timer. (Argudin et al., 2010). Antallet af personer, der er ramt af SFP, er kun et skøn på grund af fejldiagnoser og mindre udbrud, som ikke rapporteres. Hospitalsindlæggelse er sjælden, men er blevet bemærket hos personer, der er immunsvækkede, især ældre og meget unge (Scallan et al., 2011).

Stafylokokker er normalt til stede på menneskers hud og slimhinder med ca. 20-30 % for vedvarende og 60 % for intermitterende kolonisering (Kluytmans et al., 2005). Fødevarehåndterende personer, der er koloniseret med enterotoxigene stafylokokker, anses for at være den vigtigste kilde til fødevareforurening ved direkte kontakt med produkterne eller kontaktflader. Dyr som f.eks. malkekvæg kan også være bærere af stafylokokker og kan udgøre en kilde til kontaminering af mælk og mælkeprodukter. Endelig kan stafylokokker, der findes i miljøet, overføres til fødevarer, der tjener som en potentiel kilde til kontaminering (Gutiérrez et al., 2012).

Fødevarer, der almindeligvis er forbundet med SFP, omfatter forarbejdede fødevarer, kød, fjerkræ, mejeriprodukter og bageriprodukter. Når fødevarerne først er kontamineret, kan der forekomme vækst af stafylokokker og produktion af enterotoksiner, især hvis der ikke følges gode fremstillingsbetingelser, der forhindrer vækst, såsom køleopbevaringsforhold eller varmeafdøvende trin såsom pasteurisering (Gutiérrez et al., 2012). Stafylokokke enterotoksiner er varmestabile og denatureres ikke, medmindre de udsættes for høje temperaturer i lange perioder, dvs, autoklave ved 121 °C (250 °F) ved 15 PSI i 60 minutter (CDC, 2007).

Staphylococcus aureus er oftest forbundet med udbrud af stafylokokker i forbindelse med fødevareforgiftning, men andre enterotoksiske koagulasepositive stafylokokker som S. hyicus og S. intermedius har også været involveret i udbrud (Hennekinne et al., 2010). Stafylokokke enterotoxiner (SE’er) er pyrogene exotoxiner med superantigen aktivitet. Enterotoxiner er kugleformede proteiner, der er resistente over for varme og proteaser med en molekylær størrelse på gennemsnitligt ca. 25 kDa. Den mængde toksin, der er nødvendig for at forårsage sygdom, anslås at være meget lille. I et udbrud i forbindelse med chokolademælk blev der påvist niveauer af SEA på 0,5 ng/ml (Evenson et al., 1988), og der blev påvist 0,38 ng/ml SEA i et udbrud i forbindelse med mælkepulver (Asao et al., 2003).

Klassiske SE’er (SEA-SEE) og ikke-klassiske SE’er, SEG, SEH, SEI, SER og SET, har dokumenteret emetisk aktivitet. Emetisk aktivitet for de SE-lignende enterotoxiner SElJ-SElQ, SElS, SElU og SElV er endnu ikke påvist. Alle se- og sel-gener er blevet lokaliseret på mobile genetiske elementer, herunder bakteriofager, patogenicitetsøer, plasmider eller transposoner (Argudin et al., 2012).

Detektion af SE’er er altafgørende for fødevaresikkerheden og beskyttelsen af fødevareforsyningen. SE-detektionsmetoder er baseret på kommercielt tilgængelige polyvalente enzyme-linked immunoassays (ELISA) eller enzyme-linked fluorescerende immunoassay (EFLA) med antistoffer, der påviser SEA-SEE. Monovalente metoder er specifikke for SEA-SEE og kan anvendes til at skelne mellem disse typer. Metoderne kræver ekstraktion af enterotoxin fra mistænkte fødevarer før analysen. Metodens følsomhed og selektivitet forbedres med dialysekoncentration af fødevareekstraktet, men af tidsmæssige årsager kan det være nødvendigt at foretage indledende test uden koncentration. Dialysekoncentration bør dog foretages på alle mejeriprodukter inden analysen (Hennekinne et al., 2012).

FORSIGTIG: Stafylokokke enterotoksiner er meget giftige, og procedurer, der kan skabe aerosoler, bør udføres i et godkendt biologisk sikkerhedsskab (BSC). Stafylokokke enterotoksiner (SEA, SEB, SEC, SED og SEE) er selekterede agenser. Forskere skal følge de retningslinjer, der er fastsat af CDC: https://www.selectagents.gov/faq-general.html.

  1. Særligt udstyr og materialer
    1. Temperaturstyret rum eller køleskab 2-8°C.
    2. Blender eller homogenisator.
    3. Inkubator 35-37°C.
    4. Analytisk vægt og vejeskibe.
    5. Dialysebakke.
    6. pH-måler. pH-værdien under ekstraktionen og pH-værdien af de buffere, der anvendes i ekstraktionen, er vigtig. Der foretages justeringer inden for ± 0,1 pH-enhed.
    7. Kølet centrifuge 2-8°C.
    8. Laboratorieudstyr i glas eller polypropylen for at undgå toksinadsorption.
    9. Filterdug anvendes til opsamling af affald efter centrifugering. Ofte anvendes flere lag forudvådt groft ostelærred til at udføre denne opgave.
    10. Separtortragt.
    11. Dialysemembran MWCO 6,000-8,000 Dalton (f.eks. Spectra/Por® med lukninger) flad bredde 23 ± 2 mm.
    12. Vakuumfiltreringsanordninger til koniske rør (0,22 µm membran), f.eks. Steriflip (EMD Millipore), anbefales til filtrering af flydende kultursupernatanter som en sikkerhedsforanstaltning for at undgå aerosolisering af enterotoksiner.
    13. Biologisk sikkerhedsskab.
  2. Reagenser

    Bemærk: Kitproducenter kan kræve forskellige buffere eller opløsningsmidler.

    1. Phosphatbufferet saltvand (PBS-opløsning) pH 7,3 + 0,2 (NaCl/Na2HPO4: 145 mM/10 mM) Til fremstilling af 1 l PBS opløses 9 g NaCl og 3,58 g Na2HPO4 i 1 l destilleret vand. Juster pH-værdien til 7,2 ± 0,2 med HCl.
    2. Natriumchlorid (NaCl).
    3. Natriumphosphat (Na2HPO4).
    4. Polyethylenglycol (PEG) (20 000 mol wt) Fremstil en 30 % (w/v) PEG-opløsning ved at tilsætte 30 g PEG til hver 70 ml destilleret vand.
    5. 1 N (eller 0,1 N) NaOH.
    6. 1 N (eller 0,1 N) HCl.
  3. Tilberedning af dialysemembran
    Dialysemembranen skæres lang nok til at rumme det fødevareekstrakt, der skal koncentreres. Slangerne lægges i blød i 2 skift af destilleret vand for at fjerne glycerolbelægningen. Der anvendes en membranlukning eller bindes den ene ende af slangen med 2 knuder tæt sammen. Røret fyldes med destilleret vand og testes for utætheder ved at klemme den fyldte sæk sammen, mens den åbne ende holdes tæt lukket. Tøm sækken og læg den i destilleret vand indtil brug.
  4. Ekstraktion af enterotoksin fra fødevareportion

    BEMÆRK: Denne procedure og andre procedurer, der kan generere aerosoler af patogene mikroorganismer eller enterotoksiner, bør udføres i et godkendt biosikkerhedsskab.

    1. Mal om muligt hele fødevareproduktet eller portioner fra repræsentative udvalg af produktet i en blender for at homogenisere prøven, så eventuel SE, der er til stede i fødevaren, fordeles jævnt.
      1. For oste med skorpe tages osteprøve med 10 % skorpe og 90 % ost.
      2. For tørrede produkter anvendes lige store mængder vand med produktet til blanding eller producentens anvisninger følges.
    2. Væg 25 g prøve i et glasbægerglas, og overfør prøveportionen til en blender med 40 ml destilleret vand og blend ved høj hastighed i 3 minutter, hvorved der dannes en homogeniseret opslæmning. Der tilsættes ikke vand til flydende prøver, men fortsættes til trin 3.
    3. Giv toksinet mulighed for at diffundere ved at ryste prøven ved stuetemperatur i 30 minutter.
    4. Assurificer blandingen med 0,1N HCl til en pH-værdi på mellem 3,5 og 4,0. Bemærk: Hvis pH falder til under 3,0, skal der fremstilles endnu en portion på 25 g.
    5. Den syrnede opslæmning overføres til 50 ml koniske propylenrør. Centrifugeres ved 3 130 × g i 20 min. ved 5 °C. Der kan anvendes lavere hastigheder med længere centrifugeringstid, men rensning af visse fødevarer er ikke så effektiv. Separering af fedtstoffer er ineffektiv, medmindre fødevarerne centrifugeres ved køletemperatur.
    6. Dekantere supernatantvæske i 800 ml bægerglas gennem ostelærred eller andet egnet filtreringsmateriale, der er anbragt i en skilletragt. Hvis supernatanten ikke er klar, centrifugeres der igen, og væsken dekanteres gennem ostelærredet. pH-værdien testes og skal ligge mellem 3,5 og 4,5. Hvis pH-værdien er korrekt, neutraliseres blandingen med 0,1N NaOH for at opnå en pH-værdi mellem 7,4 og 7,6.
    7. Hvis pH-værdien er >4,5 gentages syrningen, men hvis <3,0 eller=””>9,0 gentages processen med en anden 25 g fødevareportion.
    8. Såfremt der er tilstrækkelig prøve til rådighed til gentagelse af testen, kan der udtages en alikvot til screening ved hjælp af et valideret assay (se afsnit H). Hvis screeningsresultaterne er negative, skal det resterende ekstrakt koncentreres med dialyse og testes igen.
  5. Dialysekoncentrering af ekstraktet
    1. Det resterende ekstrakt anbringes i en forberedt dialysesæk. Læg den lukkede sæk ned i en bakke, og nedsænk sækken i 30 % (w/v) PEG. Holdes ved 5 °C, indtil volumen er reduceret til 15-20 ml eller mindre. Denne proces kan tage 24-72 timer, men hvis volumenet ikke er reduceret efter nattens opbevaring, tilsættes pulveriseret PEG til bakken. Sækken fjernes fra PEG, og ydersiden vaskes grundigt med vand for at fjerne eventuel PEG, der klæber til sækken. Læg den i blød i destilleret vand i 1-2 minutter. Hæld indholdet i et lille bægerglas.
    2. Skyld indersiden af sækken med 2-3 ml destilleret vand (PBS anvendes til mælk og mejeriprodukter) ved at køre fingrene op og ned på ydersiden af sækken for at fjerne materiale, der klæber til slangens sider. Skylningen gentages, indtil skyllevandet er klart. Hold volumen så lille som muligt.
    3. Justér pH-værdien af ekstraktet til 7,4-7,6.
    4. Koncentrerede ekstrakter bør analyseres inden for 48 timer og opbevares ved 3-5 °C, ellers fryses ekstrakterne ved 18-20 °C og optøes helt ved 3-5 °C inden testning. Nogle assays såsom Vidas SET2 kræver øjeblikkelig analyse.
  6. Testning af SE fra bakteriekulturer

    Stafylokokkerstammer, der mistænkes for at producere enterotoksiner, kan forhåndsberiges i næringsbouillon såsom TSB eller BHI.

    1. Overfør to eller tre morfologisk ens kolonier til 10 mL næringsbouillon.
    2. Inkubér 35-37°C natten over på en orbital shaker.
    3. Kentrifuger kulturerne 5 minutter 3500 × g ved 10°C
    4. Filtrer supernatanten ved hjælp af en Steri-Flip vakuumfilteranordning med et 0,22µm filter eller et andet lukket system for at undgå aerosolisering af enterotoksiner. Denne procedure skal udføres i et biologisk sikkerhedsskab for at sikre forskerens sikkerhed.
    5. Kultursupernatanter kan have høje niveauer af SE, der ligger uden for kittets lineære område, hvilket kan kræve fortynding med PBS.
  7. Rapportering af resultater

    Forekomst af stafylokok-enterotoxin påvist i fødevarer skal rapporteres til det føderale Select Agent Program, der forvaltes af Center for Disease Control and Protection (CDC): https://www.selectagents.gov/form4.html ved at udfylde APHIS/CDC-formular 4.

    Positive resultater skal rapporteres som Staphylococcal entertoxoin påvist i × g (ml) produkt. Negative resultater skal rapporteres som Staphylococcal enterotoxin ikke påvist i × g (ml) produkt.

  8. Bemærkninger

    Sættet skal kunne påvise enterotoxin på mindst 0,05ng/g med høj relativ følsomhed (>90%) og relativ specificitet (>90%).

    Antalen af handelsnavne eller kommercielle produkter i metoden har udelukkende til formål at give videnskabelig information og indebærer ikke anbefaling eller godkendelse fra U. S. Food and Drug Administration. To metoder, der almindeligvis anvendes til påvisning af SE, omfatter den AOAC-godkendte Vidas SET2 (bioMerieux, Inc.), som er en automatiseret polyvalent enzyme linked fluorescent assay (EFLA), der påviser SEA-SEE (AOAC Official Method 2007.06 VIDAS SET2 for Detection of Staphylococcal Enterotoxin in Select Foods, Final Action, 2010). Det nuværende katalognummer for Vidas Set2 er Ref. 30705. Ridascreen SET Total (R-Biopharm AG) er et manuelt enzymrelateret immunoassay, der udføres i brønde belagt med polyvalente antistoffer. Det polyvalente Ridascreen-kit påviser stafylokok-enterotoxinerne SEA-SEE og er blevet valideret og verificeret ved grundige ringforsøg og valideringsundersøgelser foretaget af tredjepart under ledelse af Den Europæiske Unions referencelaboratorium for koagulasepositive stafylokokker med henblik på det af Den Europæiske Standardiseringsorganisation (CEN) foreslåede ISO-standard 19020-mandat. Der findes et monovalent kit Ridascreen Set A,B,C,D,E (R-Biopharm AG), men dette kit er ikke blevet valideret af en tredjepart. Katalognummeret for det polyvalente sæt Total-sæt er R4105 (96 test) eller R4106 (48 test) . Katalognummeret for SET A,B,C,D,E monovalent kit er R4101.

Interferencer

Interferencer kan forekomme i fødevarer, der har endogene enzymer såsom lactoperoxidase eller alkalisk fosfatase, og interferere med kits såsom Vidas SET2, der anvender alkalisk fosfatase som detektionsenzym (Vernozy-Rozand, et al., 2005). Det anbefales, at alle positive resultater bekræftes med en alternativ metode, der anvender et andet detektionsenzym. I tilfælde af Vidas SET2 er en alternativ metode Ridascreen SET Total, der anvender lactoperoxidase.

Der kan foretages en varmebehandling for at fjerne endogen alkalisk fosfatase fra prøven på følgende måde:

  • Overfør 600 μL koncentreret ekstrakt til et rør
  • Varme 80 °C i 2 minutter
  • Opfør Vidas SET2-assayet igen med det afkølede koncentrat. Der kan forekomme et vist tab af enterotoxin.

Hvis der er mistanke om et unøjagtigt resultat ved anvendelse af Ridascreen eller et andet kit, der anvender lactoperoxidase, overføres 100 μl koncentreret ekstrakt til et reagensglas. Der tilsættes 50 μl hver af substrat- og chromagen-kitopløsningerne. Bland og observer for en blågrøn farve. Hvis der opstår en blågrøn farve, er det tegn på, at der er intrinsisk lactoperoxidase til stede i prøven, som forstyrrer analysen. Der skal derfor anvendes en anden detektionsmetode.

  1. Argudin, MA, Mendoza, MC, og Rodicio MR. Fødevareforgiftning og Staphylococcus aureus enterotoxiner. Toxins 2010, 2, 1751-1773.
  2. Argudin, MA, Mendoza, MC, Gonzáalez-Hevia, MA, Bances, M, Guerra, B, og Rodicio MR. Genotyper, indhold af eksotoksingener og antimikrobiel resistens hos Staphylococcus aureus-stammer genfundet fra fødevarer og personer, der håndterer fødevarer. AEM 2012 78 2930-2935.
  3. Asao, T, Kumeda, Y, Kawai, T, Shibata, T, Oda, H, Nakazawa, H, og Lozaki, S. An extensive outbreak of staphylococcal food poisoning due to low-fat milk in Japan: estimate of of entertoxin A in the incriminated milk and powdered amagermælk. Epidemiol. Infect., 2003, 130, 33-40.
  4. Centers for Disease Control/National Institutes of Health. Biosikkerhed i mikrobiologiske og biomedicinske laboratorier. Fifth Edition, 2007, Evenson, ML, Hinds, MW, Bernstein, RS, Befgdoll, MS. Estimering af den humane dosis af stafylokok-enterotoxin A fra et stort udbrud af stafylokok-foodforgiftning i forbindelse med chokolademælk. Int J Food Microbiol 1988, 31, 311-316.
  5. Gutiérrez, D, Delgado, S, Vázquez-Sánchez, D, Martinez, B, Caba, ML, Rodriguez, A, Herrera, JJ, and Garcia, P. Incidence of Staphylococcus aureus and Analysis of Associated Bacterial Communities on Food Industry Surfaces (forekomst af Staphylococcus aureus og analyse af associerede bakteriesamfund på overflader i fødevareindustrien). AEM 2012, 78, 8547-8554.
  6. Hennekinne, JA, Ostyn, A, Fuillier, F, Hervin, S, Prufer, AL, og Dragacci, S. How Should Staphylococcal Food Poisoning Outbreaks be Characterized? Toxins, 2010, 2, 2106-2116.
  7. Hennekinne, JA, De Buyser, MA, og Dragacci, S. Staphylococcus aureus and its food poisoning toxins: characterization and outbreak investigation. FEMS Microbiol Rev, 2012, 36, 815-836.
  8. Kluytmans, JAJW, og Wertheim, HFL. Nasal transport af Staphylococcus aureus og forebyggelse af nosokomielle infektioner. Infection 2005, 33, 3-8.
  9. Scallan E, Hoekstra RM, Angulo FJ, Tauxe RV, Widdowson M-A, Roy SL, et al. Foodborne illness acquired in the United States-major pathogens. Emerg. Infect. Dis. 2011 Jan. http://www.cdc.gov/EID/content/17/1/7.htm
  10. Vernozy-Rozand, C., Mazuy-Cruchaudet, C., Bavai, C., og Richard, Y. (2004), Comparison of three immunological methods for detecting staphylococcal enterotoxins from food. Lett App Microbiol, 2004, 39, 490-494 . doi:10.1111/j.1472-765X.2004.01602.x

Leave a Reply