Origin of the electrophoretic force on DNA in solid-state nanopores

Voltage-drevet transport af makromolekyler gennem biologiske6,7 og kunstige8,9,10,11,12 nanoporer er et ideelt system til at studere fysikken i translokationsprocessen13. Elektroforisk migration er den vigtigste drivkraft for DNA-translokation gennem nanoporer og er en konsekvens af den kraft, der udøves af et eksternt påført elektrisk felt på ladningerne på polyelektrolytkæden. Da DNA i opløsning er negativt ladet, skærmes det af et lag af mere eller mindre mobile, positivt ladede modioner, som også udsættes for det elektriske felt. Det har længe været anerkendt, at den kraft, der udøves på modionerne, inducerer en hydrodynamisk modstandskraft på DNA’et, som lokalt afbalancerer den elektriske kraft, hvilket fører til en meget langsommere migration end den, der ville være forventet ud fra Stokes modstandskraft alene (se f.eks. ref. 1). Den elektroforetiske translokation af en polymer gennem en lille pore adlyder lignende principper, men her forventes porens geometri (eller gelens lokale struktur) at have stor indflydelse på den hydrodynamiske strømningsprofil omkring DNA’et og dermed på den modstandskraft, der modvirker bevægelsen1,5,14. På trods af stadig mere sofistikerede eksperimenter3,12,15,16 er der endnu ikke blevet rapporteret om en entydig manifestation af hydrodynamiske interaktioner i DNA-translokation. Her behandler vi dette spørgsmål ved hjælp af vores nyligt udviklede apparat, der kombinerer nanoporer i faststof med optiske pincetter3 til at standse DNA-translokation og efterfølgende måle den standsningskraft på en enkelt DNA-streng (se afsnittet Metoder). Et skematisk diagram af måleapparatet er vist i fig. 1a.

a, Skematisk diagram af måleapparatet. Ved hjælp af en optisk pincet standses DNA-translokationen, og kraften på DNA’et måles. Nanoporens ioniske ledningsevne måles også samtidig. b, Cylindrisk model af DNA i en nanopore. De blå pile på hver side af DNA’et viser skematisk hastigheden af den bevægelige væske på grund af elektroosmose.

I modsætning til et gelelektroforeseforsøg er det elektriske felt i et nanoporeforsøg begrænset til porens umiddelbare nærhed, og de elektriske kræfter virker lokalt på et kort segment af DNA’et. Den elektriske feltstyrke i porerne når typisk op på ∼106 V m-1 på grund af de meget tynde (∼60 nm) fritstående membraner. Den store persistenslængde af λ-DNA, ca. 50 nm, sikrer, at DNA-segmentet inde i poren praktisk talt er fuldt udstrakt. Situationen er skematisk afbildet i fig. 1b, hvor L og R repræsenterer porens længde og radius, og ΔV er det anvendte potentiale. DNA har en ladningstæthed λbare=-0,96 nC m-1 (2 elektroner pr. basepar) og er her modelleret som en ensartet ladet cylinder med en radius på a=1,1 nm. Den nøgne elektrostatiske kraft på DNA-ryggen er repræsenteret ved Fbare=λbareΔV (ref. 3). Den modsvares af en modstandskraft Fdrag, der skyldes elektroforetiske bevægelser af dets modioner i den modsatte retning: Fdrag er således en iboende komponent i translokationsprocessen, som i sidste ende også kan spores til elektriske kræfter5. Den resulterende nettokraft er den elektroforetiske kraft, der driver translokationen, og er givet ved Felec=Fbare-Fdrag. I vores tilfælde er Felec afbalanceret af en modsatrettet mekanisk kraft Fmech=-Felec fra den optiske pincet, der fastholder DNA’et inde i poren.

Fdrags oprindelse ligger i den rumlige fordeling af ionerne og den tilsvarende væskestrømningsprofil. En middelfeltbeskrivelse af ionfordelingerne er givet ved Poisson-Boltzmann-formalismen, hvor det elektrostatiske potentiale er givet ved og de tilsvarende ionfordelinger som . Her er λD Debye-længden, er det reducerede elektrostatiske potentiale, e er elementarladningen, Φ er potentialet, kB er Boltzmann-konstanten, T er temperaturen, n er ionernes tæthed og z er ionernes valensitet. Figur 2a viser beregnede potentialer for to porestørrelser, der er opnået ved numerisk evaluering af Poisson-Boltzmann-ligningen i en cylindrisk geometri (se afsnittet Metoder). De tilsvarende ionfordelinger er vist i fig. 2b. Debye-laget i DNA’et er karakteriseret ved en udtømning af koioner, mens modioner hober sig op til meget høje tætheder på grund af den høje DNA-ladning. Da disse fordelinger er løsninger på den fulde (ikke-lineariserede) Poisson-Boltzmann-ligning, er effekten af Manning-kondensering17 medtaget.

a, Reduceret elektrostatisk potentiale for en “stor” pore (grøn, R=10 nm) og en “lille” pore (blå, R=3 nm). Den grå linje angiver porevægens placering for den lille pore. Saltkoncentrationen er cbulk=20 mM (λD=2,2 nm), og porevæggene er for enkelhedens skyld antaget som uladede i denne beregning. b, Tilsvarende ionfordelinger. I “store” porer (R≫λD) påvirkes fordelingen af ioner omkring DNA’et ikke væsentligt af porevæggen, hvilket fremgår af observationen af, at de grønne kurver når op på bulkværdien. I “små” porer (R≲λD) komprimeres modionskyen (faste kurver) imidlertid af porevæggen, og poren kan tømmes for koioner (stiplede kurver), således at der hovedsagelig er positive modioner tilbage til at afbalancere de negative ladninger på DNA’et. Denne situation er illustreret ved de blå kurver. c, væskehastighedsprofiler beregnet ved at kombinere resultaterne fra a og b med Stokes-ligningen. d, Normaliseret overfladeintegral af forskydningsspændingen ved hver position r, beregnet som , hvor τ er forskydningsspændingen i væsken. Ved DNA-overfladen er . e, Beregnede reducerede overfladepotentialer for DNA (rød) og nanoporevæggen (grå) som en funktion af poreradius. Det grå område skildrer kvalitativt den “lille pore”-region, hvor ionfordelingerne påvirkes af nanoporens indeslutning.

I vores DNA-stalling-eksperiment bestemmer fordelingen af modionerne i høj grad hastighedsprofilen af den inducerede elektro-osmotiske strømning. Strømningshastighedsprofilen kan beregnes ved at løse Stokes-ligningen , hvor η er væskens dynamiske viskositet, vz er væskehastigheden, Ez er det påførte elektriske felt og ρ(r) er ionladningsfordelingen. De beregnede væskestrømningsprofiler er vist i fig. 2c. For at sætte strømningsprofilen i forbindelse med viskositetsmodstanden beregnes forskydningsspændingen i væsken som τ(r)=-η(dvz/dr). Figur 2d viser , som er lig med forholdet Fdrag/Fbare, når det vurderes ved DNA-overfladen (r=a). Det viser, at Fdrag er af samme størrelsesorden som den nøgne elektrostatiske kraft, der virker på det DNA, som den modvirker. Fdrag er større for den større pore, hvilket svarer til en mindre stallingkraft.

Til sammenligning med vores eksperimenter er det praktisk at udtrykke ovenstående model i en form, der direkte relaterer den elektroforetiske kraft til nanoporens egenskaber. Som tidligere vist5 kan Poisson-Boltzmann- og Stokes-ligningerne kombineres for at give et udtryk for den elektroforetiske kraft på et stationært molekyle,

Φ(a) og Φ(R) er overfladepotentialerne for henholdsvis DNA’et og nanoporen, og ε er vandets dielektriske konstant. og udledt af Poisson-Boltzmann-ligningen er plottet i fig. 2e som en funktion af R. I store porer er overfladepotentialerne uafhængige af R. Ligning (1) forudsiger derefter, at den målte kraft Fmech har en simpel ln-1(R/a) afhængighed af porestørrelsen. I mindre porer er Debye-laget på den anden side komprimeret af porevæggen (fig. 2). Dette resulterer i en afhængighed af overfladepotentialerne af porestørrelsen og en tilsvarende mere kompliceret afhængighed af Fmech af R.

En måde at teste ovenstående model direkte på er at måle DNA-stallingkraften Fmech som en funktion af poreradius R. Da tidligere arbejde har fokuseret på mindre porer, viser vi dog først, at det er muligt at detektere tilstedeværelsen af et enkelt DNA-molekyle i meget store (R≫a) nanoporer. Påvisningen af DNA i porten er baseret på måling af skridtet i den ioniske konduktans ΔG, når DNA kommer ind i porten. ΔG blev tidligere vist at være forårsaget af konkurrence mellem to bidrag: volumeneksklusion, der sænker antallet af ioner, der er tilgængelige for konduktans, og et overskud af DNA-modioner, der effektivt øger antallet af ioner, der er tilgængelige for konduktans12. Hvilken af disse to virkninger, der dominerer, afhænger af elektrolytkoncentrationen i bulk, hvilket medfører, at ΔG er positiv (konduktansforøgelse) i de nuværende forsøg med 20-50 mM salt. Under disse optimerede saltforhold forudses signal/støjforholdet ved DNA-indfangning at være højt selv i meget store porer18. Et typisk trin i strømmen sammen med den tilsvarende ændring i perlens position Z er vist i fig. 3a. Vi observerer et tydeligt trin i strømmen, selv om DNA’et ændrer nanoporens ledningsevne med mindre end 1 %. Et typisk histogram af indfangningshændelser er vist i fig. 3b. Disse data viser, at vi er i stand til kontrolleret at indsætte og detektere enkeltmolekyler selv i nanoporer med R=45 nm, hvor DNA’et kun dækker 1/2000 af nanoporens tværsnitsareal.

a, Typisk eksempel på porestrøm I (øverste panel, rødt gennemsnit) og perleposition Z (nederste panel) under DNA-indfangning i en R=39 nm pore i 33 mM KCl ved 80 mV. Strømmålingerne blev lavpasfiltreret ved 1 kHz. b, Histogram af ΔG for 88 DNA-indfangninger i nanoporen under de samme betingelser som i a. c, ΔG i porer med forskellige radius. Indfangningshændelser fandt typisk sted ved spændinger på 60-100 mV. Den vandrette stiplede linje er en vejledning for øjet. Trekanter: 20 mM KCl, stjerner: 33 mM KCl, diamanter: 50 mM KCl, grøn stjerne: data fra b, fejlbjælker: standardafvigelse vurderet ud fra ΔG-histogrammer. De åbne symboler repræsenterer data fra eksperimenter med fri translokation uden optiske pincetter.

Eksperimentelt bestemte ΔG-værdier som funktion af nanoporernes radius er vist i fig. 3c for 10 nanoporer med radius fra R=3 til 45 nm. Det grå område angiver den “lille pore”-region, hvor ionfordelingerne nær DNA’et ifølge beregningerne i fig. 2b påvirkes af tilstedeværelsen af nanoporens væg i henhold til beregningerne i fig. 2b. I tilsyneladende overensstemmelse med simuleringerne er ΔG omtrent konstant i store nanoporer. Den større ΔG i små nanoporer er i overensstemmelse med komprimeringen af det diffuse skærmende lag, der sikrer ladningsneutralitet i porerne. En mere kvantitativ sammenligning af den målte ΔG med teorien er imidlertid vanskelig: Adgangsmodstanden Racc bliver et stadig vigtigere bidrag til systemets samlede modstand i store porer19 , og det er i øjeblikket ukendt, hvordan tilstedeværelsen af DNA, der trækkes gennem porerne, påvirker Racc.

Når vi har fastslået, at det er muligt at standse og detektere DNA-molekyler i store såvel som små porer, vender vi os nu til hovedresultatet i dette brev, nemlig den eksperimentelt bestemte størrelse af standsningskraften Fmech som funktion af nanoporens radius R. Figur 4a viser Fmech som en funktion af den påførte spænding ΔV i nanoporer med R=4 nm (venstre panel) og R=39 nm (højre panel). Dette forhold er omtrent lineært i begge tilfælde. Fmech/ΔV i den lille pore er dog en faktor to større end i den store pore. Figur 4b viser forholdet Fmech/ΔV som en funktion af porestørrelsen: Fmech/ΔV falder gradvist med stigende størrelse, som forventet på grundlag af ligning (1). Den stiplede kurve er resultatet af en kombination af overfladepotentialerne for den fulde DNA-ladning (fig. 2e) med ligning (1) uden ekstra justeringer. På trods af de iboende forenklinger af en endimensionel model fanger det teoretiske resultat ret godt tendensen i dataene, selv om det kvantitativt overvurderer stallingkraften med ∼50%. Denne forskel kan tilskrives (en kombination af) flere faktorer, herunder en reduktion af modionmobiliteten ved DNA-overfladen12,20 eller en ekstra modsatrettet elektro-osmotisk væskestrømning som følge af faste ladninger på nanoporeoverfladen5. Med hensyn til ligning (1) kan begge virkninger repræsenteres ved at sænke størrelsen af overfladepotentialdifferencen ΔΦ=Φ(a)-Φ(R), hvorved størrelsen af Fmech reduceres. En empirisk reduktion af ΔΦ med 33 % resulterer i den faste kurve i fig. 4b, som er en fremragende tilpasning til de eksperimentelle data. Denne reduktion af ΔΦ svarer til, at ca. 50 % af DNA’s nøgne ladning skærmes af ioner, der effektivt er immobiliseret på dets overflade (som vist i supplerende fig. S1) eller til tilstedeværelsen af en overfladeladning på 15 mC m-2 på porevæggen (supplerende fig. S2). Selv om vores eksperiment ikke direkte kan skelne mellem disse to mekanismer, er den udledte overfladeladningstæthed typisk for SiO2-overflader21. Dette tyder på, at overfladeladningstætheden i vores nanoporer ikke er stærkt påvirket af fremstillingsprocessen, og at poreladningen er ansvarlig for en væsentlig del af den observerede korrektion.

a, Målinger af stallingkraften som funktion af det påførte potentiale i en lille (venstre panel) og en stor nanopore (højre panel). I hvert tilfælde er to målinger, der er opnået ved forskellige afstande mellem perlen og nanoporen, vist. b, Målt kraft i forhold til poreradius. De blå og grønne symboler svarer til dataene i a. Dataene i området med den lille pore blev taget fra ref. 3. Kurverne repræsenterer det teoretiske resultat for den nøgne DNA-ladning (stiplet kurve) og for en reduceret ΔΦ (gennemgående linje, se tekst). Indsætningen viser skematisk, hvordan kraften på DNA-modionerne fordeles mellem DNA’et og porevæggene gennem viskos modstand i en lille og en stor pore; den gule pil repræsenterer den nøgne elektrostatiske kraft, der virker på DNA’et. Trekanter: 20 mM KCl, stjerner: 33 mM KCl, diamanter: 50 mM KCl. Fejlbjælkerne stammer fra usikkerhederne i kalibreringen af den optiske fælde, som anslås til 10-30% af den kalibrerede fældestivhed.

Eksterne faktorer, som der ikke er taget hensyn til i vores simple model, kan også påvirke den absolutte værdi af stallingkraften. Den kan f.eks. være påvirket af elektrostatiske og/eller hydrodynamiske kræfter på perlen eller på den del af DNA’et, der befinder sig i det elektriske felt lige uden for nanoporen. Vores eksperimenter viser imidlertid ingen beviser for sådanne virkninger, da vi ikke påviste nogen ændring i stallingkraften, når perlen blev anbragt i stigende afstand fra nanoporen3. Desuden er de eksperimentelle kraft-spændingskurver lineære i vores spændingsområde (Fig. 4a), hvilket indikerer, at de entropiske kræfter er små sammenlignet med de elektrostatiske kræfter, hvilket er i overensstemmelse med uafhængige målinger af de entropiske kræfter i DNA-strækning22.

Afhængigheden af den målte kraft af poreradius i Fig. 4b viser direkte, at den elektroforetiske kraft i DNA-translokation til dels bestemmes af hydrodynamisk kobling mellem DNA’s modioner og nanoporens væg. Nanoporens geometri bestemmer størrelsen af den modstandskraft, der udøves på DNA’et af disse modioner. Denne kobling har vigtige konsekvenser for fortolkningen af eksperimentelt bestemte kræfter, fordi disse kræfter tydeligvis ikke er bestemt af DNA’ets iboende egenskaber alene1,23.

Variationer i kraften kan også forventes med stigende saltkoncentration, fordi dette ændrer Debye-længden og dermed både DNA-overfladepotentialet og formodentlig også stalling-kraften Fmech. Denne forventning kompliceres dog af de kendsgerninger, at porernes overfladeladningstæthed også ændrer sig betydeligt med saltkoncentrationen12 , og at den her anvendte middelfeltteori bliver upålidelig ved høj ionstyrke. I tidligere eksperimenter blev Fmech faktisk fundet at være uafhængig af saltkoncentrationen op til 1 M (ref. 3), og en fortolkning af disse data baseret på en model, hvor Φ(R) afhænger af saltkoncentrationen, blev foreslået af Ghosal5.

I fri DNA-translokation er den genoprettende kraft Fmech fraværende og effektivt erstattet af et ekstra Stokes-træk FStokes, der er proportionalt med molekylets hastighed. Molekylet translocerer med konstant hastighed, idet den elektroforetiske kraft afbalanceres af FStokes. Sammenhængen mellem den forholdende kraft Fmech, som er målt med den optiske pincet, og translokationshastigheden vtrans, som er bestemt ved eksperimenter med fri DNA-translokation, er givet ved4,5,14

Dette resultat svarer til den Stokesmodstand, som en uladt cylinder ville opleve ved translokation gennem en cylinderformet pore med konstant hastighed vtrans. Fmech og vtrans er således proportionale størrelser, der er relateret med en geometriafhængig faktor. Denne forventning bekræftes kvalitativt af eksperimentelle data3,12 , som viser, at Fmech og vtrans faktisk er nogenlunde proportionale. Beregning af vtrans som λ-DNA-konturlængden divideret med den eksperimentelt bestemte translokationstid giver vtrans=(16 μm/1,1 ms)≈15 mm s-1, hvilket resulterer i Fmech/vtrans=1.750 pN s m-1 (data for 5 nm-radiusporer). Ligning (2) giver imidlertid en værdi på 249 pN s m-1 for denne faktor, idet η=1×10-3 N s m-2, L=60 nm, R=5 nm og a=1,1 nm anvendes. Dette er syv gange lavere end den eksperimentelt opnåede værdi. Translokation af DNA gennem disse porer sker derfor med en meget lavere hastighed end forventet ud fra de elektroforetiske kræfter, der er målt med den optiske pincet og middelfeltbeskrivelsen. Da der blev anvendt lignende nanoporer i alle disse eksperimenter, peger denne konklusion på en mere grundlæggende forskel mellem den statiske situation med et fastlåst molekyle og den dynamiske situation med et translokaliserende molekyle. Ved fri DNA-translokation resulterer DNA’s konformation uden for porten i ekstra modstand på det bevægelige molekyle24 , hvilket kan forklare diskrepansen.

Sammenfattende har vi vist, at den elektroforetiske kraft på et DNA-molekyle i en nanopore afhænger af porens geometri. Dette er ikke forventet ud fra simpel elektrostatik, men kan forstås direkte ved at overveje den hydrodynamiske modstand induceret af modionerne, der screener DNA’et i opløsning. Numeriske beregninger baseret på middelfeltligninger giver en god beskrivelse af porestørrelsesafhængigheden af de målte kræfter.