Neutrofil diapedesis:

Et af de klassiske træk ved inflammation er infiltration af det berørte væv med polymorphonukleære leukocytter (PMN). For at dette kan ske, skal cirkulerende PMN gennemgå adhæsive interaktioner med endothelet, som gør det muligt for dem at blive aktiveret, flade og emigrere hen over endothelforingen af mikrokarrene. De molekylære determinanter for disse adhæsive interaktioner er blevet undersøgt indgående, og der er generel konsensus om den sekvens af begivenheder, der fører til, at PMN bringes i en position, hvor de kan emigrere ind i vævet (3, 12). I første omgang opstår der en svag adhæsiv interaktion mellem cirkulerende PMN og endothelet, som resulterer i en saltatorisk bevægelse af PMN langs endothelet, et fænomen, der betegnes som rulning. Rulning gør det muligt for PMN at forblive tæt på endothelet, og hvis der er lokalt genererede inflammatoriske mediatorer til stede, aktiveres PMN’erne. Når PMN’erne er aktiveret, danner de stærkere adhæsive interaktioner med endothelet, som fører til deres arrest. Efterfølgende emigrerer PMN’erne over endothelet. I modsætning til tilfældet med de indledende adhæsive interaktioner (rulning og adhæsion), hvor der er generel konsensus om de involverede mekanismer, er der kun lidt viden om de mekanismer, der er involveret i PMN’s transendotheliale migration. Selv den grundlæggende forudsætning om, hvorvidt PMN emigrerer mellem endothelceller (paracellulær vej) eller gennem selve endothelcellerne (transcellulær vej) er kontroversiel.

Den fremherskende konsensus er, at cirkulerende PMN emigrerer fra det intravaskulære rum til interstitium ved at passere mellem tilstødende endothelceller, dvs. ved hjælp af en paracellulær vej (11). Både in vivo og in vitro-undersøgelser med elektron- og lysmikroskopi har fanget migrerende PMN, der strækker pseudopodier mellem endothelcellerne for at passere gennem endothelbarrieren som reaktion på en kemotaktisk gradient. For at PMN kan benytte den paracellulære vej til transendothelial migration, skal den adhæsive kobling mellem tilstødende endothelceller forstyrres, og endothelcellerne skal adskilles tilstrækkeligt fra hinanden til at tillade passage af PMN’erne. Mange inflammatoriske mediatorer, der anvendes til at simulere inflammation in vitro, kan i sig selv fremkalde dannelse af huller i dyrkede endothelcellemonolag, dvs. endothelcelletraktion. Da store huller mellem endothelcellerne imidlertid sjældent observeres i in vivo-modeller af inflammation, kan dette fænomen repræsentere en overdreven effekt af inflammatoriske mediatorer i in vitro-systemer. Kulturerede endothelmonolag har underudviklede interendotheliale adhæsionsforbindelser sammenlignet med deres modstykker in vivo, og derfor kan inflammatoriske mediatorer lettere producere endothelcelleindtrækning in vitro end in vivo (12). Det in vivo korrelat til dette fænomen er øget makromolekylær udsivning gennem interendotheliale junctions, der observeres som reaktion på inflammatoriske mediatorer. Tilsammen giver in vitro-undersøgelserne troværdighed til ideen om, at endothelceller kan adskille sig fra hinanden som reaktion på inflammatoriske mediatorer, om end omfanget af adskillelsen kan være overdrevet.

Eviden om, at PMN kan fremkalde endothelcelleindtrækning, stammer primært fra in vitro-undersøgelser, der har behandlet de mekanismer, der er involveret i PMN-medieret endothelcelleskade (12). Denne skade var af ikke-lytisk art og manifesterede sig som endothelcelleløsning fra monolag dyrket på ikke-porøse overflader. Denne løsrivelse af endothelcellerne skete 3-6 timer efter, at der var lagt aktiverede PMN på overfladen af endothelcellemonolag, og den er blevet tilskrevet PMN-afledt elastase. Da løsrevne endothelceller sjældent observeres i in vivo-modeller af inflammation, synes PMN-medieret løsrivelse af endothelceller også at være en overdrivelse af en in vivo-begivenhed på grund af de eksperimentelle betingelser, der er pålagt in vitro. I disse systemer (endothelmonolag dyrket på ikke-porøse overflader) får PMN’erne ikke lov til at transmigrere og bevæge sig væk fra endothelcellemonolaget. De forbliver således i umiddelbar nærhed af endothelcellerne og fortsætter med proteolytisk forværring af monolaget, hvilket i sidste ende fører til retraktion af endothelcellerne og efterfølgende løsrivelse. Hvis de aktiverede PMN får lov til at migrere hen over endothelcellemonolag, observeres der sjældent grov endothelcelleindtrækning og -afløsning.

PMN-afledt elastase kan inducere endothelcelleindtrækning og -afløsning i monolag. Dette er analogt med brugen af proteaser til at ekspandere endothelceller, dvs. at de proteasebehandlede celler trækker sig tilbage og løsner sig fra substratet, men efter behandling med proteasehæmmere kan de genudsættes og fortsætte med at vokse normalt. Det er interessant, at både tilbagetrækning af endothelceller og PMN’s transendotheliale migration kan forhindres af proteasehæmmere (f.eks. elastasehæmmere). Sidstnævnte observationer tyder på, at PMN bruger endogen elastase til at fremkalde en endothelcelletilbagetrækning, der er tilstrækkelig stor til, at de kan passere mellem tilstødende endothelceller uden at skade dem. Nylige undersøgelser tyder på, at elastase-medieret PMN transendothelial migration er en stærkt reguleret proces, som ikke kræver PMN-degranulering (3). De aktiverede PMN udskiller ikke elastase til det ekstracellulære miljø; de mobiliserer snarere elastase til membranen og lokaliserer den til den migrerende front, f.eks. pseudopodier, der trænger ind mellem tilstødende endothelceller. At PMN-degranulering ikke er nødvendig for deres transendotheliale migration understøttes yderligere af observationen af, at PMN-cytoplaster (anukleare PMN uden granulat) migrerer gennem endothelmonolag som reaktion på en kemotaktisk gradient lige så effektivt som normale PMN. Igen kan cytoplasternes transendothelmigration forhindres af elastasehæmmere.

Endothelceller holdes sammen af adhæsionsforbindelser, der består af transmembranproteiner (11). For at neutrofile kan passere mellem endothelcellerne, skal de adhæsive interaktioner i disse junctions således forstyrres. Der findes to adhæsionsforbindelser, der er relevante for PMN’s transendotheliale migration: adherensforbindelser og tight junctions. Adherens-knudepunkterne består af vasculære-endotheliale (VE)-cadherin/cateninkomplekser. VE-cadherin har et ekstracellulært domæne, der interagerer homotypisk med VE-cadherin på tilstødende endothelceller. Det cytoplasmatiske domæne af VE-cadherin associerer med intracellulære β- eller γ-cateniner. Disse VE-cadherin/cateninkomplekser er forbundet med actincytoskelettet via α-catenin (fig. 1A). Tight junctions består af flere transmembranproteiner, herunder occludin og claudins 1 og 2, og associerede intracellulære proteiner, såsom ZO-1, -2 og -3, som forbinder tight junction-proteinerne med cytoskelettet. Af disse to adhæsionsforbindelser har virkningen af PMN’s transendotheliale migration på adherens junctions fået mest opmærksomhed.

Nylige undersøgelser med konfokal mikroskopi viser, at PMN-adhæsive interaktioner (adhæsion og transendothelial migration) kan resultere i lokal forstyrrelse af adherens junction-proteinerne (10). To populationer af PMN blev fanget ved at klæbe til endothelcellemonolag: 1) dem, hvorunder der ikke var nogen afbrydelse af kontinuiteten af adherens junction-proteinerne, og 2) dem, hvorunder der var afbrydelse af adherens junction-proteinerne. Forstyrrelsen af adherens junction-kontinuiteten ved adhærente PMN var et lokalt fænomen, da adherens junctions længere væk fra PMN’erne ikke blev påvirket. En systematisk analyse viste, at adherens junction-proteiner under adhærente PMN blev påvirket i rækkefølge, dvs. at β-catenin gik tabt før VE-cadherin. PMN, der blev fanget i forbindelse med transendothelial migration, var uvægerligt forbundet med tab af alle adherens junction-proteiner på migrationsstedet. Igen var der ingen effekt på adherens junction-integriteten på steder, der var længere væk fra de migrerende PMN. Endvidere er der følgende beviser for betydningen af adherens junction disruption i PMN transendothelial migration: 1) in vivo øgede antistoffer mod VE-cadherin PMN-udvandringen, og 2) in vitro øgede antistoffer mod VE-cadherin PMN’s transendotheliale migration og inducerede reorganisering af det endotheliale actincytoskelet, hvilket resulterede i dannelse af huller mellem endothelceller.

Med hensyn til tight junction-komplekser er der i nyere undersøgelser gjort lignende observationer. PMN transendothelial migration forstyrrede kun ZO-1 og -2 kontinuiteten på det sted, hvor PMN trængte ind i de interendotheliale junctions (1). Der blev ikke konstateret udbredte diskontinuiteter i tight junctions.

Potentielle mekanismer involveret i paracellulær diapedesis

Mekanismen, hvormed PMN-endothelcellernes adhæsive interaktioner forstyrrer adherens junction, er uklar. En mulighed er, at adherente PMN bruger endogene proteaser til at nedbryde adherens junction-proteiner (Fig. 1A). Elastasehæmmere var f.eks. i stand til at mindske omfanget af PMN-induceret tab af de adherens junction-proteiner VE-cadherin og β-catenin (2). Andre undersøgelser (11) viser, at aktiverede PMN kan nedbryde VE-cadherin, og at en elastasehæmmer kan forhindre denne nedbrydning. Desuden producerer renset neutrofilt elastase nedbrydningsprodukter af VE-cadherin svarende til dem, der er konstateret efter nedbrydning af denne adherens junction-komponent af aktiveret PMN. Tilsammen synes det sandsynligt, at PMN-afledt elastase spiller en rolle i nedbrydningen af adherens junction.

PMN-endothelcellernes adhæsive interaktioner kunne også signalere endothelcellerne til aktivt at deltage i PMN’s transendotheliale migration ved at adskille sig fra hinanden, dvs. interendothelial gap-dannelse (Fig. 1A). Denne påstand støttes af følgende beviser. Adherente PMN kan fremkalde stigninger i endothelcellernes Ca2+-niveauer, og chelatering af dette Ca2+ resulterer i en hæmning af PMN’s transendotheliale migration. Desuden reducerer hæmning af endothelial myosin light-chain kinase (en vigtig determinant for interendothelial cell gap-dannelse) PMN’s transendotheliale migration (11). Endelig påvirker adhærente PMN, som påpeget ovenfor, det intracellulære β-catenin før det plasmamembranoverskridende VE-cadherin. Tilsammen tyder disse observationer på, at endothelceller kan induceres til at deltage aktivt i PMN’s transendotheliale migration ved at trække sig tilbage fra hinanden.

Evidens til fordel for transcellulær diapedesis

Mange tidlige og nyere rapporter, der har undersøgt leukocytdiapedesis in vivo ved hjælp af en ultrastrukturel tilgang, tyder på, at størstedelen af PMN’erne forlader vaskulaturen transcellulært, dvs, gennem porer eller passager, der krydser det endotheliale cytoplasma. Undersøgelse af serielle sektioner ved hjælp af transmissionselektronmikroskopi tyder på, at PMN’er kan vandre gennem områder, der ikke er forbundet med identificerbare celle-celleforbindelser (4, 5, 8). Det er blevet hævdet, at selv serielle snit ikke entydigt beviser, at der ikke var en celle-celleforbindelse i nærheden, men snarere at den kan være blevet overset. Desuden kan det være vanskeligt at identificere elektrontætte adherens junctions, især i de områder, hvor endotheliet er <0,5 μm højt. Endelig tyder nylige in vitro-data på, at celle-celle adherens junctions molekylært nedbrydes under PMN-diapedesis (10), og derfor ville man ikke forvente at se dem morfologisk.

Scanningselektronmikroskopibilleder giver mere overbevisende beviser for, at PMN’er trænger ind i endothelceller gennem åbninger, der ikke er forbundet med endotheliale celle-cellekontakter (4, 9). PMN’er, der er i gang med diapedesis, ser ud til at have en dumbbell-form med en indsnævring i området i niveau med endothelet (4, 5, 7, 8, 9, 13, 15). Afhængigt af, hvor langt diapedesen er fremskreden, ses en bobleagtig forlængelse, der enten stikker ud i karlumen eller strækker sig ind i interstitium (5, 9, 11, 15). Dette tyder på, at leukocytterne klemmer sig gennem en cirkulær pore med en lille, begrænset diameter snarere end at fremkalde tilbagetrækning af individuelle endothelceller fra hinanden. Endothelcellen og leukocytten forbliver i tæt kontakt under hele diapedesen. Endothelet ser ofte ud til at sprede sig langs den luminale side af PMN-overfladen for at opsluge den fuldstændigt og derved lukke det luminale hul, før PMN’en frigives i vævsmatrixen (4, 5, 8). Denne proces er ofte blevet observeret under emigration in vivo, men det er ikke blevet påvist, at den forekommer under transendothelial migration in vitro.

Potentielle mekanismer involveret i transcellulær diapedesis

Men selv om det er vanskeligt at anvende stringente mekanistiske tilgange i in vivo-undersøgelser, er der tilstrækkelige indicier til at understøtte flere mulige mekanismer, hvormed PMN emigrerer transcellulært. Det er tænkeligt, at de transcellulære porer, hvorigennem PMN migrerer, er et resultat af proteolytisk skade på endothelet. Det er imidlertid blevet påpeget, at endothelet, i det mindste ultrastrukturelt set, forbliver ubeskadiget og fortsætter med at danne caveolae og endocytotiske vesikler selv i membranområder, der er i tæt kontakt med PMN (13). Det er mere sandsynligt, at PMN, som ser ud til at migrere over korte afstande langs den apikale endotheloverflade, søger tynde områder af endothelet, såsom fenestrae. Fenestrae kan være åbne (50 nm i diameter) eller være omgivet af en membran, der er lige så tyk som to plasmamembraner (uden cytoplasma). PMN kan således let passere gennem åbne fenestrae eller proteolytisk passere gennem fenestrae med membran uden at beskadige det egentlige endothel. Fenestrae kan udgøre en vigtig vej for PMN-udvandring i de organer, der indeholder fenestrerede mikrokar (f.eks. gastrointestinal mucosa, sekretoriske kirtler).

I organer, der indeholder kontinuerlige mikrokar (f.eks. hud, muskler), kan PMN bruge caveolae eller pinocytotiske vesikler og indsætte filopodier i dem for at trænge igennem endothelbarrieren. Disse strukturer, der har en diameter på mellem 50 og 100 nm, menes at formidle proteintransport gennem endothelet og udgør en ekstrajunktionel rute for vaskulær proteinlækage under inflammation. For nylig er det blevet påvist, at caveolae danner vesiculo-vacuolære organeller, som kan danne små sammenhængende membranbundne passager på tværs af cytoplasmaet i en endothelcelle (6). Det er blevet påvist, at dannelsen af sådanne caveolae og vesikler fortsætter i områder af endotheloverflademembranen, der er i kontakt med klæbende PMN’er (13). Desuden forlænger PMN’er, der klæber tæt til endothelcellens overflade, ofte fingerlignende filopodier ind i fordybninger i den apikale plasmamembran, hvorved de omformer endotheloverfladen (4, 7, 8). Den fremspringende kraft fra et adhærerende filopodium i dannelsen af vesiculo-vakuolære organeller kan føre til fremkomsten af dette filopodium på den abluminale endothelside (Fig. 1B), hvor det let kan interagere med den ekstracellulære matrix og sprede sig ud langs den (Fig. 1B).

En koncentration af F-actin og mikrofilamenter i førende pseudopodier af PMN er blevet påvist under diapedesis in vivo (15) og in vitro (3) og kan generere den kraft, der er nødvendig for at trække fremadskridende cellulære processer med gennem de transcellulære porer. Porerne kan udvide sig til en størrelse på 3-5 μm, hvorigennem leukocytterne let kan passere. Denne udvidelse af den indledende vacuolære pore kan til dels opnås ved hjælp af kræfter, der genereres af spændinger i det kortikale mikrofilamentsystem, som findes i den sfæriske del af leukocytten, der stadig stikker ud i karlumen. Faktisk er der blevet observeret en koncentration af F-actin i den caudale region af transmigrerende PMN’er i de sene stadier af diapedesis (15). Desuden kan cytoskeletalomlægning i det endotheliale cytoplasma hjælpe udvidelsen af den transendotheliale pore, som det tidligere er blevet foreslået (14). Poredannelsesprocessen vil blive ledsaget af en spredning af apikale endothelmembranområder langs PMN-celleoverfladen, hvilket fører til en eventuel opslugning af de luminale PMN-porer i endothelet, som det er blevet påvist i elektronmikrografer (fig. 1B). Denne aktive deltagelse af endothelet ville bidrage til en hurtig genlukning af endothelforingen og derved begrænse proteinlækage.

Summary

Fra denne gennemgang af beviserne er det tydeligt, at PMN kan bruge både paracellulære og transcellulære veje til at krydse endothelbarrieren under inflammation. Det er værd at påpege, at PMN’s transendotheliale migration in vitro favoriserer den paracellulære vej, mens PMN’s transendotheliale migration in vivo favoriserer den transcellulære vej. Hvis man teleologisk antager, at den transmigrerende PMN vil vælge den vej med mindst mulig modstand, kan der være en forklaring på den tilsyneladende uoverensstemmelse mellem de resultater, der er opnået ved hjælp af in vitro- og in vivo-tilgange.

I endotelcellemonolag, der dyrkes i kultur, er de mest svækkede områder nær celle-celle-knudepunkterne, og det er derfor ikke overraskende, at dette er det foretrukne sted, hvor diapedesis forekommer. I dyrkede endothelceller er de intercellulære junctions desuden ustabile strukturer, der konstant adskilles og samles igen. Et sådant område ville være let tilgængeligt for pseudopodier fra transmigrerende leukocytter. Der er også beviser for, at selv in vitro er den paracellulære vej, som PMN benytter under diapedesis, specifikt udvalgt, dvs. diapedesis sker fortrinsvis ved tricellulære hjørner snarere end mellem to endothelceller (1). Adherens junctions og tight junctions er diskontinuerlige ved disse tricellulære hjørner og udgør således den vej med mindst mulig modstand for de transmigrerende PMN. I modsætning hertil er interendotheliale junctions meget bedre udviklet in vivo og er mere modstandsdygtige over for proteinbevægelser på tværs af dem. PMN kan således foretrække at bruge porerne i det tynde område af endothelcellerne, såsom fenestrae eller caveolae, som vejen med den mindste modstand.

At tilskrive den foretrukne vej (paracellulær vs. transcellulær), der anvendes af PMN under diapedesis, til, om der blev anvendt in vitro- eller in vivo-tilgange til at studere dette fænomen, er navnlig en overforenklet forenkling. Der er mange eksempler på afvigelser fra dette paradigme. Der er f.eks. beviser for, at PMN kan benytte den paracellulære vej in vivo og den transcellulære vej in vitro. Hvis den transcellulære vej er den foretrukne vej for PMN-diapedesis in vivo, hvorfor ændrer interferens med junctionalproteiner så dramatisk PMN-diapedesis in vivo? Det kan meget vel være, at denne diskussion vil fortsætte i mange år fremover, ligesom diskussionen om, hvorvidt transendothelial proteinbevægelse fortrinsvis sker via den paracellulære eller den transcellulære vej. Man kan forestille sig, at argumenterne vedrørende PMN’s transendotheliale migration til dels kan tilskrives arten af det inflammatoriske respons eller arten af den vaskulære seng, hvori det sker. Forhåbentlig vil yderligere undersøgelser give yderligere oplysninger, som vil gøre det muligt at løse denne kontrovers.