Kemisk derivatisering i bioanalyse

Anvendelser

Kemisk derivatisering har længe vist sig som en analytisk teknik i bioanalyse for at overvinde problemer i forbindelse med lav ioniseringseffektivitet, ustabilitet af forbindelser, dårlig selektivitet eller uacceptabel kromatografisk ydeevne (dårlig retention, dårlig peakform og carryover-problemer) og endda dårlig volatilitet for GC-separation . Denne teknik er et effektivt redskab inden for mange områder af kemien, bl.a. inden for medicin, retsmedicin, fødevarevidenskab, dopingkontrol og miljøfag. Målet med kemisk derivatisering er at ændre strukturen af analysanden (enten nukleofil eller elektrofil) ved hjælp af et kemisk reagens (enten elektrofil eller nukleofil afhængigt af analysandens art), hvorved der dannes en ny forbindelse (reaktionens derivat) med forbedrede kemiske og fysiske egenskaber med henblik på analyse. Reaktionsbetingelserne (mængden af reagenset, reaktionstid og -temperatur osv.) optimeres til fordel for dannelsen af det ønskede derivat med det størst mulige reaktionsudbytte. Der kan udvikles yderligere procedurer til rensning af prøverne for at fjerne uønskede biprodukter og overskydende reagenser og derved minimere analyteafledninger ved analysen.

Med kemisk derivatisering bliver det muligt at analysere det umulige. Mange eksempler herpå er blevet præsenteret i litteraturen; de har indflydelse på GC-, LC-MS/MS- og NMR-detektion. Det mest bemærkelsesværdige har været den kromatografiske adskillelse af enantiomerer gennem chiral derivatisering ved hjælp af specifikke opløsningsreagenser uden brug af specialiserede chirale kolonner og separationsbetingelser.

Overvejelser

Vælgelse af det passende kemiske reagens er afgørende for en vellykket derivatisering og afhænger af den specifikke anvendelse. Generelt gælder det, at hvis målanalytten er nukleofil (forbindelse med et overskud af elektroner), vælges en elektrofil (forbindelser med et samlet elektronmangel) som reagens og omvendt. Reagenserne skal være selektive (rettet mod et specifikt sted i molekylet), hvorved derivatisering på flere steder i målmolekylet, metabolitterne eller de endogene komponenter undgås. For et molekyle, der indeholder både hydroxyl- og aminofunktionelle grupper, bør man f.eks. undgå at anvende syreklorider eller anhydrider som derivatiseringsreagenser, da disse vil derivatisere begge funktionelle grupper. Derimod er det hensigtsmæssigt at anvende dansylchlorid som derivatiseringsreagens til amino- og phenolfunktionelle grupper, da det ikke reagerer med alifatiske alkoholer. Andre krav, der skal tages i betragtning ved valget af reagens, omfatter tilgængelighed (kommercielt), renhed og pris. Typisk er prisen på reagenser minimal og udgør derfor ikke en hindring for anvendelsen.

Med optimerede betingelser er kemiske derivatiseringsprocedurer typisk robuste nok til at blive anvendt til farmaceutisk bioanalyse og kan opfylde de lovmæssige forventninger. Dette påvises normalt under en streng valideringsproces, hvor flere parametre, herunder, men ikke begrænset til, nøjagtighed, præcision, selektivitet, matrixeffekt osv. Valget af intern standard er afgørende for at korrigere for et eventuelt analyttab i løbet af de forskellige trin i prøvehåndteringen og bioanalysen og dermed sikre assayets robusthed. Hvis det er muligt, bør der anvendes en deuterium- eller 13C-stabil intern standard, ellers kan en analog med lignende reaktivitet, genfindelse og kromatografiske egenskaber erstattes. Det er også vigtigt at overveje og evaluere, hvor det er muligt, metaboliske veje for den pågældende analysand; omdannelse af metabolitter tilbage til modermolekylet skal undgås under derivatiseringsproceduren, da disse processer ofte indebærer barske betingelser (pH, varme, lang inkubationstid osv.). Desværre kan dette kompliceres af manglen på referencestandarder for metabolitterne og manglen på metaboliske oplysninger tidligt i lægemiddeludviklingens livscyklus på grund af differentierede eller accelererede udviklingsstrategier.

Kemisk derivatisering som en kunstform

Anvendelsen af kemisk derivatisering er faldet i de seneste år, efterhånden som nye separationsteknologier har udviklet sig og er blevet mere almindelige. Udviklingen af superkritisk væskekromatografi (SFC) har f.eks. åbnet en ny vej for chiral stereoisomerisk analyse, hvorved behovet for chiral derivatisering i visse tilfælde er blevet reduceret . Mere følsomme generationer af triple quadrupol-massespektrometriske instrumenter med nye eller forbedrede ioniseringsteknologier presser detektionsgrænserne til et lavt picogramniveau, og som følge heraf er efterspørgslen efter kemisk derivatisering for at forbedre analysens følsomhed (gennem forbedret ionisering eller selektivitet) faldet. Andre teknologier, herunder UHPLC, mikro/nano-LC (til bedre ioniseringseffektivitet) og TOF-instrumenter med ionmobilitet (elektronisk separation i stedet for kemisk/fysisk separation) har også bidraget til nedgangen i kemisk derivatisering i bioanalytiske laboratorier. Når det er sagt, anvendes teknikken dog stadig til meget komplekse separationer, hvor de nævnte teknologier ikke har tilstrækkelig effekt. Undertiden har en kobling af kemisk derivatisering med en af disse teknologier en forbedret/tillægsmæssig virkning. Navnlig har kombinationen af SFC med chiral derivatisering vist sig at være bedre til chiral separation end SFC-analysen (data ikke vist)

På grund af denne nedgang i teknikken og dens kompleksitet sammenlignet med andre analyseteknikker har kemisk derivatisering udviklet sig til en speciel “kunstform” i laboratoriet, som kræver specialiserede færdigheder kombineret med stærke kemiske færdigheder. Som følge heraf lykkes det færre forskere i DMPK-miljøer at beherske teknikken og blive dygtige til at anvende den. Spørgsmålet er så, hvordan man kan bevare disse færdigheder og videregive dem til de kommende generationer af analytiske forskere. Særnumre som dette, oversigtsartikler, bogkapitler, vejledninger med eksperimentelle protokoller vil forhåbentlig lette og fremme brugen af kemisk derivatisering som et fantastisk analytisk værktøj.

Outline

Dette temanummer dækker fremskridt inden for eksisterende derivatiseringsteknikker, der anvendes i bioanalytisk forskning, samt innovative nye metoder og tilgange (f.eks, kombination af derivatisering med microflow LC-MS og ideen om nye kemiske tagging-teknikker af Niwa et al. ).

Dette nummer har til formål at dække aspekter relateret til:

• Derivatiseringsmetoder i LC-MS bioanalyse (herunder HPLC);

• Peptidderivatisering til analyse af proteinterapeutika;

• Chirale derivatiseringsreagenser anvendt på biologiske prøver (se Vashistha et al. );

• Derivatiseringen til analyse af endogene forbindelser (se “Beyond Classical Derivatization: Analyte ‘derivatives’ in the bioanalysis of endogenous and exogenous compounds’ af Barnaby et al. , eller ‘Derivatization of steroids in biological samples for GC-MS and LC-MS analyses’ af Marcos et al. );

• Derivatiseringsmetoder i forbindelse med dopingkontrol af mennesker (se interessant gennemgang af Athanasiadou et al. ).

Selv om det er rigtigt, at kemisk derivatisering blot er endnu et redskab i den bioanalytiske værktøjskasse, er det et “must have” for et DMPK-laboratorium og et redskab, der fortsat vil få betydning for mange bioanalytiske udfordringer.

Derfor, hvis du ikke kan lide din analysand, så skift den (med kemisk derivatisering, det vil sige)!