Kalciumalginat og kalciumalginat-chitosan perler indeholdende celecoxib solubiliseret i en selvemulgerende fase
Abstract
I dette arbejde blev der udviklet alginat og alginat-chitosan perler indeholdende celecoxib solubiliseret i en selvemulgerende fase for at opnå et lægemiddelafgivelsessystem til oral administration, der er i stand til at forsinke frigivelsen af lægemidlet i surt miljø og fremme den i tarmrummet. Begrundelsen for dette arbejde var knyttet til ønsket om at forbedre celecoxibs terapeutiske effektivitet ved at reducere dets bivirkninger ved maven og fremme dets anvendelse til profylakse af tyktarmskræft og som adjuvans i behandlingen af familiær polyposis. Systemerne blev fremstillet ved ionotropisk gelering ved hjælp af nåle med forskellige diametre (400 og 600 μm). Morfologi, partikelstørrelse, svulmende adfærd og in vitro lægemiddelfrigivelse af perlerne i vandige medier med forskellige pH-værdier blev undersøgt. De eksperimentelle resultater viste, at tilstedeværelsen af chitosan i formuleringen forårsagede en forøgelse af perlestrukturens mekaniske modstand og som følge heraf en begrænsning af perlens svulmeevne og et fald i lægemiddelfrigivelseshastigheden ved neutral pH. Alginat-chitosan perler kunne være et godt redskab til at garantere en celecoxib levering i tyktarmen.
1. Indledning
Lægemiddelafgivelsessystemer, der indeholder bionedbrydelige naturlige polymerer, er genstand for flere og flere forskningsundersøgelser i betragtning af de fordele, som disse materialer kan tilbyde . Blandt dem er dem, der indeholder alginat og chitosan, blevet udnyttet i vid udstrækning på det farmaceutiske område.
Alginat er en vandopløselig naturlig biopolymer, der udvindes af brune alger og består af vekslende blokke af 1-4 α-L-guluronsyre- og β-D-mannuronsyrerester . Denne polymer danner hydrogeler i tilstedeværelse af tosidige kationer som Ca2+, Ba2+, Sr2+ og Zn2+, og denne egenskab gør det muligt at fremstille lægemiddelbelastede perler . Mekanismen for denne geleringsproces involverer guluronrester med den specifikke chelatering af Ca2+ , der danner den såkaldte “æggeboks”-struktur . Mange forskere har fokuseret deres opmærksomhed på udviklingen af calciumalginatperler som kontrollerede lægemiddelafgivelsessystemer til oral indgivelse af lægemiddelmolekyler og proteiner .
Chitosan er et biokompatibelt, bionedbrydeligt, ikke-toksisk, lineært polysaccharid bestående af D-glucosamin- og N-acetyl-D-glucosaminenheder, der er forbundet med β-(1-4)-glykosidiske bindinger . Chitosan kan afledes ved delvis deacetylering af chitin fra krebsdyrskaller og anvendes i vid udstrækning til cellekultur, lægemiddelformidling og fødevaretilsætningsstoffer .
Krydsforbindelse af alginat og chitosan i en hydrogel anvendes til at fremstille materialer, der er nyttige til medicinske og farmaceutiske anvendelser; de opnåede systemer er kendetegnet ved øget stabilitet sammenlignet med dem, der opnås med en enkelt polymer . I kontrolleret lægemiddelafgivelse har alginat-chitosan-polyelektrolytkomplekset fået stor opmærksomhed i de seneste år . De to polymerer danner polyelektrolytkomplekset via den ioniske vekselvirkning mellem carboxylresterne i alginat og aminoresterne i chitosan. Alginat-chitosanperlerne kan fremstilles ved forskellige metoder: to-trins-procedure og et-trins-procedure . I den første metode fremstilles gelperler af calciumalginat ved at lade en opløsning af alginat falde ned i et geleringsbad, der indeholder calciumioner. De resulterende perler overføres derefter i en chitosanopløsning for at danne en membran på deres overflade. Denne et-trins-procedure kræver, at dråberne af alginatopløsningen falder ned i en vandig opløsning, der indeholder både geleringsmidlet til alginat (f.eks. calciumioner) og chitosan . Valget af fremstillingsmetode er ansvarlig for perlernes egenskaber på grund af mængden af bundet chitosan i det resulterende produkt. Samtidig påvirkes perlernes egenskaber af molekylvægten af de valgte polymerer og/eller af procentdelen af de forskellige rester i polymermolekylerne .
Celecoxib, et fluoreret benzenesulfonamidderivat, er et ikke-steroidalt antiinflammatorisk lægemiddel (NSAID) med en meget selektiv cyclooxygenase-2 (COX-2)-hæmmende virkning. Det har antiinflammatorisk, analgetisk og antipyretisk virkning på grund af hæmning af prostaglandinsyntesen, der katalyseres af COX-2. For nylig er dette lægemiddel ofte blevet undersøgt for sin kræftbekæmpende aktivitet ved hjælp af in vitro- og in vivo-modeller . Prækliniske undersøgelser af celecoxib rapporterede om en fremtrædende anticanceraktivitet mod pladecellekræft i hoved og hals, tyktarmskræft, brystkræft og lungekræft .
I dette arbejde blev der udviklet alginat- og alginat-chitosankugler indeholdende celecoxib solubiliseret i en selvemulgerende fase med henblik på at opnå et lægemiddeltilførselssystem til oral indgift, der kan forsinke frigivelsen af lægemidlet i surt miljø og fremme den i tarmkompartmentet. Begrundelsen for dette arbejde var knyttet til ønsket om at forbedre celecoxibs terapeutiske effektivitet ved at reducere dets bivirkninger ved maven og fremme dets anvendelse til profylakse af tarmkræft og som adjuvans i behandlingen af familiær polyposis . Formålet med den aktuelle undersøgelse var at evaluere og sammenligne egenskaberne af celecoxib-belastede calciumalginat- og calciumalginat-chitosan-kugler med celecoxib. Morfologi, partikelstørrelse, hæveadfærd og in vitro lægemiddelfrigivelse af perler i vandige medier med forskellig pH blev undersøgt.
2. Materialer og metoder
2.1. Materialer
Celecoxib blev indhentet fra Chemos GmbH (Regenstauf, Tyskland). Vandfri calciumchlorid og natriumalginat (molekylvægt 120000-190000 g/mol; 1,56 mannuron-guluroniske rester i forholdet 1,56) blev købt hos Sigma Aldrich (Milano, Italien), mens chitosan med lav molekylvægt kom fra Fluka (Milano, Italien). Labrasol (caprylocaproyl macrogol-8 glycerider) var en gave fra Gattefossè (Milano, Italien); TPGS (D-α-tocopheryl polyethylenglycol 1000 succinat) blev venligst doneret af Isochem (Gennevillers, Frankrig). Alle andre kemikalier var af analytisk kvalitet.
2.2. Fremstilling af calciumalginatperler
Calciumalginatperler blev fremstillet ved geleringsmetode ved hjælp af calciumioner som tværbindingsmiddel. I detaljer blev en 1,5 % (w/w) natriumalginat-vandig opløsning blandet med en lægemiddelbelagt selvemulgerende fase i forholdet 4 : 1 og tilsat dråbe for dråbe til en 100 mM CaCl2-opløsning . Den selvemulgerende fase blev fremstillet ved at blande afvejede mængder Labrasol og TPGS ved 50 °C og opløse celecoxib i opløsningen af hjælpestoffet. Emulsionen (natriumalginatopløsning og selvemulgerende fase) blev manuelt ekstruderet i hærdningsbadet gennem nåle med en indre diameter på 400 eller 600 μm under konstant let omrøring ved stuetemperatur. Efter 15 minutter blev perlerne opsamlet, vasket med deioniseret vand for at fjerne overskuddet af calciumioner og derefter tørret ved 40 °C natten over. Sammensætningen af de fremstillede formuleringer, med koderne CAl 600 og CAl 400, er anført i tabel 1.
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
2.3. Fremstilling af calciumalginat-chitosankugler
Calciumalginat-chitosankugler (identificeret som CAlCh 600 og CAlCh 400) blev fremstillet i henhold til et-trinsmetoden. Proceduren var identisk med den, der blev anvendt i forbindelse med alginatperler med den undtagelse, at hærdningsbadet var en 0,2 % (w/w) chitosanopløsning i fortyndet eddikesyre (1 %) indeholdende CaCl2 i en koncentration på 100 mM. Sammensætningen af chitosanformuleringerne er angivet i tabel 1.
2.4. Morfologisk analyse og analyse af partikelstørrelse
Morfologien af de våde og tørrede perler og partikelstørrelsen af de tørrede perler blev analyseret ved hjælp af et Motic SMZ168 stereomikroskop og et billedanalyseprogram (Motic Image Plus 2.0). For hver formulering blev partikelstørrelsen beregnet som den gennemsnitlige værdi af størrelsen af 20 tørrede partikler.
2,5. Lægemiddelindhold
Seks milligram lægemiddelholdige tørrede perler blev solubiliseret i fosfatbufferopløsning (100 mL) ved pH 6,8 tilsat 0,75 % (w/v) natriumlaurylsulfat ved 70 °C under omrøring i to timer. Efter afkøling blev de opnåede opløsninger filtreret og analyseret spektrofotometrisk ved 255 nm; resultaterne er et gennemsnit af mindst tre bestemmelser.
2.6. Hævningsundersøgelse
Opsvømmelsesundersøgelser blev udført ved 37°C på tørrede perler, der blev anbragt i tre vandige medier karakteriseret ved forskellige pH-værdier: saltsyre ved pH 1,0 og fosfatbuffer ved pH 6,8 og pH 7,4.
Nøjagtigt afvejede mængder af tørrede perler af calciumalginat og calciumalginat-chitosan blev anbragt i glaskolber indeholdende 5 mL af hver væske. Efter faste tidsintervaller (5, 15, 30, 60 og 120 minutter) blev prøverne opsamlet, forsigtigt tørret af med papir og vejet igen. Perlernes dynamiske vægtændring i forhold til tiden, defineret som svulmegraden (Sw), blev beregnet i henhold til følgende ligning: hvor er vægten af perlerne i svulmende tilstand på tidspunktet og er de tørrede perlers oprindelige vægt .
2.7. Undersøgelse af frigivelse af celecoxib
In vitro-undersøgelserne af frigivelse blev udført i saltsyre ved pH 1,0 og i fosfatbuffer ved pH 6,8 og ved pH 7,4 tilsat 0,75 % natriumlaurylsulfat for at garantere opretholdelsen af vaskebetingelserne. Undersøgelserne blev udført ved at anbringe nøjagtigt afvejede mængder af hver formulering, svarende til 8 mg celecoxib, i 500 mL af den valgte væske ved 37 °C under en rotationshastighed på 100 rpm (apparat 2, padle). Filtrerede prøver blev udtaget med bestemte tidsintervaller uden udskiftning og analyseret for celecoxibindholdet ved hjælp af et UV-spektrofotometer ved 255 nm, når væsken var HCl og fosfatbuffer ved pH 6,8, eller ved 256 nm, når der var tale om fosfatbuffer ved pH 7,4. Hvert eksperiment blev udført i tre eksemplarer.
Den præstation for lægemiddelfrigivelse af calciumalginat og calciumalginat-chitosan perler blev sammenlignet ved hjælp af opløsningsparametrene t10%, t50% og t90%, som angiver de tidspunkter, hvor 10%, 50% og 90% af lægemidlet blev frigivet, og f2 lighedsparameteren . For at kurver kan anses for at være ensartede skal f2-værdierne ligge tæt på 100, og f2-værdier over 50 (50-100) sikrer, at de to kurver er ensartede eller ækvivalente.
2.8. Statistisk analyse
Resultaterne blev statistisk analyseret for at teste signifikante forskelle ved hjælp af Student’s t-test med et 95 % konfidensinterval; værdier under 0,05 blev betragtet som statistisk signifikante.
3. Resultater og diskussion
Alginat- og alginat-chitosankugler blev fremstillet ved ionotropisk geleringsmetode ved at lade en emulsion, bestående af en vandig opløsning af alginat og den selvemulgerende fase med lægemiddelbelastning, dryppe gennem 23 G (600 μm) eller 27 G (400 μm) nåle i et calciumchlorid- eller et calciumchlorid-chitosan geleringsbad. De hjælpestoffer, der blev valgt til den selvemulgerende fase, var Labrasol, en flydende komponent med selvemulgerende og opløselighedsforbedrende egenskaber, og D-α-tocopherylpolyethylenglycol 1000-succinat som koemulgerende og absorptionsforbedrende middel (tabel 1). Sammensætningen af den selvemulgerende fase var den samme som i et tidligere arbejde.
Stereomikroskopiske billeder af våde og tørre alginat- og alginat-chitosan-kugler er vist i figur 1 og 2. Umiddelbart efter fremstillingen viser CAl 600-kugler (figur 1(a)) en regelmæssig form og homogene dimensioner; de er hvide og uigennemsigtige med en glat, blank og homogen overflade.
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
Tørringsprocessen ændrer ikke perlernes form, men fører til en reduktion af deres dimensioner og ændrer karakteristikken af deres overflade, som er uregelmæssig og rynket (figur 1(b)). Vandtabet medfører en reduktion af afstanden mellem de polymere kæder og en ændring af perlernes struktur, som ikke er kompakt og sammenhængende, men består af små mikrokerner, der klæber til hinanden. De fuldt opsvulmede CAlCh 600-partikler er let gule og ret regelmæssige i deres form og har en glat overflade (figur 1(c)). I dette tilfælde påvirker tørringsprocessen perlernes sfæriske form (figur 1(d)); de bliver ellipsoide, deres dimensioner mindskes, og deres overflade er meget ru. Efter tørring observeres der desuden en delvis agglomerering af perlerne på overfladen, hvilket skyldes chitosans klæbende egenskaber. For perler fremstillet med en 400 μm-nål (figur 2(a)-2(c)) viser billederne, der er optaget umiddelbart efter fremstillingen, at for begge formuleringer (med eller uden chitosan) er partiklerne ikke homogene i diameter, selv om de er regelmæssige i deres form. CAl 400 og CAlCh 400 tørre perler (figur 2(b)) har en overflade karakteriseret ved asperitet og konkavitet; desuden er partikelformen for alginat-chitosanformuleringen fuldstændig uregelmæssig, og tilstedeværelsen af faste broer af chitosan er tydelig, som binder perlerne og hindrer deres adskillelse.
Den gennemsnitlige størrelse af celecoxib-belastede perler er mellem 715 og 896 μm (tabel 2). Diameteren af perlerne blev væsentligt påvirket af diameteren af den nål, der blev anvendt under fremstillingen (). Tilsætning af chitosan til alginatperler ændrer kun deres dimensioner væsentligt, når der blev anvendt en 400 μm-nål (). Som det fremgår af de høje værdier for standardafvigelsen, er slutproduktet ved anvendelse af 400 μm-nålen desuden en familie af partikler med uhomogene dimensioner.
|
||||||||||||||||||||||||
Alle formuleringer indeholder en høj mængde lægemiddel (tabel 2) homogent fordelt i hjælpestofmatrixen, og forskellene mellem deres lægemiddelindhold var ikke signifikante, bortset fra CAlCh 400, der var lidt lavere end de andre (). Procentdelen af celecoxib i perlerne overstiger den teoretiske værdi, og dette skyldes tabet af Labrasol i løbet af hærdningstiden, hvilket kan begrundes i betragtning af den høje affinitet mellem dette hjælpestof og vand, som driver det ud af perlerne og ind i geleringsbadet.
En særlig egenskab ved mikropartikulære systemer af alginat eller alginat-chitosan i tør form er deres evne til efter kontakt med en vandig væske at rehydrere, optage væsken og undergå en hævningsproces, der hovedsagelig er forbundet med hydrering af polymerernes hydrofiliske grupper. Når væsken er vand, trænger det ind i partiklerne og fylder porerne mellem de polymere kæder og forårsager en betydelig hævelse af systemet uden erosion/opløsning. Hvis der vælges væsker med forskellig pH-værdi, kan perlernes hæveadfærd ændres. Derfor er calciumalginatets og calciumalginat-chitosankuglernes hævelseevne blevet vurderet i HCl ved pH 1,0 og i fosfatbufferopløsninger ved pH 6,8 og 7,4 (figur 3-5).
I surt miljø (figur 3) er der ingen forskelle i de fire formuleringers hæveevne; ved denne pH er den maksimale hævelsesgrad ikke over 60 %. Alginat- og alginat-chitosankuglerne absorberer en del af væsken; deres vægt stiger i begyndelsen og forbliver derefter konstant. Ved denne pH-værdi protoniseres polymerens carboxylatgrupper, der er lokaliseret på partiklernes overflade, for alginatsystemernes vedkommende (CAl 600 og CAl 400), og der dannes et lag af alginsyre. Alginsyrens uopløselighed i denne væske og dannelsen af hydrogenbindinger, der er ansvarlige for en forøgelse af strukturstabiliteten, forhindrer indtrængning af yderligere væske i de dybere lag af partiklerne og begrænser deres hævelse. Den samme hævelsesadfærd er observeret for CAlCh 600- og CAlCh 400-systemer. Selv om chitosan i et surt miljø er meget opløseligt og ladet til omdannelse af dets aminenheder til NH3+ -opløselig form, er interaktionen mellem aminogrupper og protonerede carboxylgrupper ikke stærk nok til at fremme hævningen. Derfor domineres den begrænsede samlede hæveadfærd af calciumalginatstrukturen.
Figur 4 og 5 viser, at formuleringerne udviser en høj hæveevne ved pH 6,8 og pH 7,4. For CAl 600-formuleringen vokser partiklernes vægt hurtigt, når et højdepunkt efter 30 minutter og falder derefter brat på grund af erosion/opløsning af systemet. Denne adfærd kan skyldes ionudvekslingsreaktion mellem Na+ (der er til stede i fosfatbufferen) og Ca2+ , der er knyttet til alginatets carboxylgrupper. Monovalente ioner erstatter bivalente ioner, hvilket medfører en opløsning af “æggeboks”-strukturen og en forøgelse af afstanden mellem de polymere kæder, hvilket fremmer væskeabsorptionen og systemernes hævelse. Denne proces fortsætter, indtil det osmotiske tryk i perlerne afbalancerer styrken af de tværbindende bindinger og fysiske sammenfiltringer, som bevarer perlernes struktur. Partiklerne begynder således at gå i opløsning, og deres vægt mindskes.
Resultaterne fra hæveundersøgelsen viser, at CAlCh 600 og CAlCh 400 perler er karakteriseret ved en mere modstandsdygtig struktur sammenlignet med CAl 600 og CAl 400, hvilket sandsynligvis kan tilskrives interaktionerne mellem alginat- og chitosankæderne. Chitosankuglernes maksimale hævelsesgrad er lavere end alginatets; alginat-chitosansystemer er i stand til at nå en hævelsesligevægt efter ca. 30 minutter og til at holde deres vægt på et konstant niveau indtil forsøgets afslutning. Det er formentlig interaktionerne mellem de to polymerer, der er ansvarlige for dannelsen af partikler med en betydelig mekanisk modstand, hvilket begrænser væskeoptagelsen og strukturens opløsning. Endelig kan man ved at sammenligne hæveadfærden for CAl 400 i forhold til CAl 600 og CAlCh 400 i forhold til CAlCh 600 perler (samme sammensætning, forskellig diameter på den nål, der er anvendt i fremstillingsprocessen) konstatere, at i fosfatbuffere nåede CAl 400 og CAlCh 400 et hævemaksimum, der var højere end for henholdsvis CAl 600 og CAlCh 600.
De profiler for lægemiddelfrigivelse, der er opnået fra de forskellige formuleringer ved pH 1,0, 6,8 og 7,4, er vist i figurerne 6-8. Celecoxib-frigivelsen in vitro påvirkes af pH-værdien af den valgte væske: Procentdelen af lægemiddel, der frigives i surt medium i to timer, er ret lav og varierer mellem 12,70 % og 24,53 % (figur 6). Forsinkelsen af celecoxib-frigivelsen kan tilskrives systemernes reducerede hæveevne i denne væske; hverken perlernes sammensætning eller deres diameter påvirker lægemiddelfrigivelsen (f2-parameterværdier altid over 50). Ved pH 1,0 er frigivelsesprocessen kun styret af diffusion af lægemidlet. Dette resultat gør det muligt at opfylde det første formål med dette forskningsarbejde, som er at minimere lægemiddelfrigivelsen i surt miljø for at fremme og favorisere denne proces på tarmniveau.
I fosfatbuffer ved pH 6,8 er formuleringerne karakteriseret ved en lægemiddelfrigivelsesadfærd, der er påvirket af deres sammensætning og ikke væsentligt af deres dimensioner (figur 7). I denne væske svulmer systemerne først op og eroderer/desintegrerer derefter, og derfor drives lægemiddelfrigivelsesprocessen først af diffusion og derefter af den polymere afslapning. Alginatperler (CAl 600 og CAl 400) er i stand til at afslutte frigivelsen af celecoxib på ca. otte timer; derimod er ikke mere end 75 % af lægemidlet i alginat-chitosanperler i opløsning efter samme tid. Sammenligningen af resultaterne fra alginat- og alginat-chitosan-mikropartikelformuleringerne viser, at profilerne ikke er ens med f2-værdier på under 50. En mulig forklaring på en sådan adfærd er den elektrostatiske interaktion mellem alginatets carboxylgrupper og chitosans aminogruppe, der forbedrer den mekaniske modstandskraft af det polymere netværk, hvilket reducerer dets hævelse og erosion ved pH 6,8.
Overraskende nok aftager frigivelseshastigheden af celecoxib hovedsageligt for CAlCh 400-formuleringen, selv om denne formulering er karakteriseret ved den laveste partikelstørrelse. Sandsynligvis fører den lille diameter og det store overfladeareal af disse partikler til dannelse af et tykkere chitosanlag omkring perlerne, hvilket modvirker en stor modstand mod væskeoptagelsen og dermed mod lægemiddelfrigivelsen.
Også ved pH 7,4 kan forskellene i lægemiddelfrigivelsespræstationer tilskrives formuleringens sammensætning snarere end partikelstørrelsen (figur 8). Alle formuleringerne viste en næsten konstant lægemiddelfrigivelseshastighed. Der er ingen forskelle mellem CAl 600 og CAl 400 og mellem CAlCh 600 og CAlCh 400 frigivelseskurver; når der er chitosan i perlerne, falder lægemiddelfrigivelseshastigheden.
De samme konklusioner fremgår af analysen af resultaterne af lægemiddelfrigivelsen gennem opløsningsparametrene (t10%, t50% og t90%) (tabel 3). Forskellene i perlernes frigivelsesadfærd påvises også gennem opløsningsparametrene t10%, t50% og t90% og er tydelige for den tid, der er nødvendig for at frigive 50 og 90% af det indlæste lægemiddel. I fosfatbufferopløsninger kræver alginat-chitosankugler længere tid til at frigive 50 og 90 % af celecoxib sammenlignet med alginatkugler. Sandsynligvis fremkalder tilstedeværelsen af alginat-chitosan-komplekset en vækst af perlestrukturens strukturelle rynker, uregelmæssigheder og kompleksitet, hvilket gør frigivelsen af lægemidlet vanskelig.
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
4. Konklusioner
De undersøgte celecoxib-belastede alginat- og alginat-chitosanperler minimerer lægemiddelfrigivelsen i surt miljø, hvilket begunstiger denne proces ved tarmens pH (6,8 og 7,4). De eksperimentelle resultater viser, at tilstedeværelsen af chitosan i formuleringen er ansvarlig for en forøgelse af perlestrukturens modstandsdygtighed og som følge heraf for en begrænsning af perlens svulmeevne og for et fald i lægemiddelfrigivelseshastigheden ved neutral pH. Alginat-chitosan perler kunne være et værdifuldt medium for celecoxib til doseringsformer, der er anvendelige som adjuverende terapi hos patienter med familiær polyposis og prækancersygdom i tyktarmen.
Konkurrerende interesser
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende interesser.
Leave a Reply