Identifikation og karakterisering af et nyt botulinum neurotoksin

Søgning i genomiske databaser afslørede et nyt BoNT-gen

I et forsøg på at undersøge det evolutionære landskab for BoNT’er udførte vi iterative Hidden Markov-modelsøgninger i Uniprot-sekvensdatabasen. Vores søgning identificerede alle kendte BoNT-subtyper og mosaiktoksiner samt det beslægtede tetanusneurotoksin (Fig. 1a; Supplerende fig. 1). Til vores overraskelse afslørede søgningen en potentielt ny BoNT, der forsøgsvis blev betegnet BoNT/X (fig. 1a, GenBank nr.: BAQ12790.1), fra den nyligt rapporterede genomiske sekvens af C. botulinum stamme 111. BoNT/X viste den mindste proteinsekvensidentitet med de andre BoNT’er i parvise sammenligninger (fig. 1b). Desuden er den lave sekvenslighed jævnt fordelt over hele BoNT/X-sekvensen (fig. 1c), hvilket indikerer, at det ikke er et mosaiktoksin. På trods af denne lave sekvensidentitet er BoNT’ernes overordnede domænearrangement bevaret i BoNT/X (Fig. 1c), herunder et zinkafhængigt protease-motiv HEXXH (rest 227-231, HELVH) i LC (ref. 33) og et SXWY-motiv i HC (rest 1 274-1 277, SAWY), som genkender lipidreceptor-gangliosiderne34.

(a) Et fylogenetisk splittet netværk, der dækker alle BoNT-serotyper, subtyper, mosaiktoksiner og beslægtede tetanusneurotoksiner (TeNT), illustrerer deres potentielle evolutionære relationer samt konflikter, der skyldes f.eks. kimerismer, på grundlag af deres proteinsekvenser. BoNT/X er fremhævet med rødt. En forstørret udgave af dette panel er vist i supplerende figur 1, hvor sekvensadgangsnummeret for hvert toksin-gen er angivet. (b) Et fylogent træ af proteinsekvensalligeringen for BoNT/A-G, TeNT og BoNT/X, analyseret ved hjælp af ClustalW-metoden. Procentdelen af sekvensidentitet mellem hvert toksin og BoNT/X er angivet. (c) Øverste panel: en skematisk tegning af de tre domæner af BoNT/X, med det bevarede protease-motiv i LC og det gangliosidbindende motiv i HC noteret. Nederste panel: Analyse ved hjælp af et glidende sekvenssammenligningsvindue viste, at den lave lighed mellem BoNT/X og andre BoNT’er/TeNT’er er jævnt fordelt langs hele BoNT/X-sekvensen. X-aksen repræsenterer forespørgselssekvensens position i midten af et bevægeligt sekvenssammenligningsvindue med 100 aminosyrer. Y-aksen viser den procentvise identitetsgrad mellem dette sekvensvindue og hver af de justerede baggrundssekvenser. De to søjler øverst i grafen viser den bedst matchende sekvens (nederste søjle), og om den bedste match er signifikant adskilt fra den næstbedste match (øverste søjle). (d) En skematisk tegning af den orf-genklynge, der er vært for BoNT/X-genet (øverste panel), som har to forskellige træk sammenlignet med andre kendte orfX-klynger (midterste og nederste panel): (1) der er et ekstra orfX2-protein (betegnet orfX2b) placeret ved siden af BoNT/X-genet; (2) orfX-genernes læseramme har samme retning som BoNT/X-genet.

I lighed med de andre BoNT’er befinder BoNT/X-genet sig i en genklynge23. Alle syv etablerede BoNT’er samudtrykkes med et andet 150 kDa-protein kendt som NTNHA (non-toxic non-hemagglutininin protein), som danner et pH-afhængigt kompleks med BoNT’er og beskytter dem mod proteaser i mave-tarmkanalen35. BoNT/X-genet er også forudgået af et potentielt NTNHA-gen (fig. 1d). Ud over BoNT og NTNHA indeholder en typisk BoNT-genklynge gener, der koder for en af de to typer af accessoriske proteiner: (1) HA-klyngen, der koder for de tre konserverede proteiner HA17, HA33 og HA70, som danner et kompleks med BoNT/NTNHA og letter absorptionen af toksiner gennem tarmepitelbarrieren36,37,38; eller (2) OrfX-klyngen, der koder for de konserverede OrfX1-, OrfX2-, OrfX3- og P47-proteiner med ukendt funktion23. BoNT/X-genet er placeret i en OrfX-genklynge, hvilket også gælder BoNT/E, F og medlemmer af BoNT/A. Interessant nok har BoNT/X-klyngen to unikke træk (fig. 1d): (1) der er et ekstra OrfX2-gen, som ikke findes i andre BoNT-klynger (vi betegnede det som OrfX2b); (2) læsningsrammen for OrfX-generne er normalt modsat BoNT/NTNHA-generne, men den har samme retning som BoNT/X-genet i BoNT/X-klyngen (Fig. 1d). Disse fund tyder på, at BoNT/X er en unik gren af BoNT-familien.

LC af BoNT/X kløver VAMP2 på et nyt sted

For at karakterisere BoNT/X fokuserede vi først på dets LC (X-LC, rester 1-439) og producerede det som et His6-tagget protein i Escherichia coli. LC’er af BoNT/A (A-LC) og BoNT/B (B-LC) blev fremstillet og analyseret parallelt som kontroller. Inkubation af X-LC med detergentekstrakter fra rottehjerne (BDE) påvirkede ikke syntaxin 1 eller SNAP-25, men ophævede VAMP2-immunoblot-signalerne (Fig. 2a). LC’er af BoNT’er er zinkafhængige proteaser33. Som forventet forhindrede EDTA spaltning af SNARE-proteiner af X-, A- og B-LC’er (Fig. 2a). Desuden konverterede inkubation af X-LC med det oprensede rekombinante cytosoliske domæne af VAMP2 (resterne 1-93) VAMP2 til to bånd med lavere molekylvægt (Fig. 2b), hvilket bekræfter, at X-LC kløver VAMP2.

(a) X-LC blev inkuberet med BDE. Immunoblot-analyse blev udført for at påvise syntaxin 1, SNAP-25 og VAMP2. Synaptophysin (Syp) tjente som belastningskontrol. A-LC og B-LC blev analyseret parallelt. Spaltning af VAMP2 ved B-LC resulterer i tab af immunoblot-signaler, mens spaltning af SNAP-25 ved A-LC genererer et mindre fragment (markeret med en asterisk). EDTA blokerede aktiviteten af X-, A- og B-LC’er. (b) VAMP2 (1-93) blev inkuberet med X-LC. Prøverne blev analyseret ved SDS-PAGE og farvning med Coomassie Blue. X-LC omdannede VAMP2 (1-93) til to mindre fragmenter. (c-e) VAMP2 (1-93) blev inkuberet med X-LC. Prøverne blev analyseret ved massespektrometri (LC-MS/MS) for at bestemme molekylvægten af de spaltede fragmenter. Eluderede peptidpeaks fra HPLC-kolonnen er plottet over løbetiden (RT, X-akse). Massespektrometri-data for de to spaltningsprodukter er farvekodet med angivelse af masse-til-ladningsforholdet (m/z). Molekylvægten er udledt ved at multiplicere m med z og derefter trække z fra. Proteinsekvenserne for de to spaltningsprodukter er farvekodet og anført i c. (f) Sekvensalligning mellem medlemmer af VAMP-familien med spaltningsstederne for BoNT/B, D, F, G og X markeret med rødt og de to SNARE-motiver i blå nuancer. (g) HA-mærkede VAMP1, 3, 7 og 8 og Myc-mærkede Sec22b og Ykt6 blev udtrykt i 293T-celler via transient transfektion. Cellelysater blev inkuberet med X-LC og underkastet immunoblot-analyse. Actin er en belastningskontrol. (h) GST-mærkede Ykt6 blev inkuberet med X-LC (100 nM). Prøverne blev analyseret ved SDS-PAGE og farvning med Coomassie Blue. (i) GST-tagged VAMP2 (33-86), VAMP4 (1-115) og VAMP5 (1-70) blev inkuberet med X-LC (100 nM). Prøverne blev analyseret ved SDS-PAGE og farvning med Coomassie Blue. X-LC spaltede både VAMP4 og VAMP5. Vi bemærker, at VAMP5-proteinet indeholder et kontaminerende bånd, der løber tæt på spaltningsproduktet. (j) Eksperimenterne blev udført som beskrevet i a, bortset fra at VAMP4 og Sec22b blev detekteret. Synaptotagmin I (Syt I) er en belastningskontrol. X-LC spaltede native VAMP4 i BDE. Et af to (b,g,j) eller tre (a,h,i) uafhængige eksperimenter er vist.

For at identificere spaltningsstedet analyserede vi VAMP2 (1-93)-proteinet med eller uden forudinkubation med X-LC ved væskekromatografi-tandem-massespektrometri (LC-MS/MS, Fig. 2c-e). Der fremkom et enkelt dominerende peptidpeak efter inkubation med X-LC (fig. 2c,e; supplerende fig. 2). Dens molekylvægt er 3 081,7, hvilket kun passer til peptidsekvensen af A67-L93 af VAMP2 (Fig. 2c,e). Tilsvarende blev der også påvist et andet fragment fra begyndelsen af His6-tag’et til rest R66 af VAMP2 (Fig. 2d). For yderligere at bekræfte dette fund gentog vi assayet med et andet VAMP2-fragment: glutathion S-transferase (GST) tagget VAMP2 (33-86) (Supplerende fig. 3) (Supplerende fig. 3). Inkubering med X-LC genererede et enkelt dominerende peptidpeak med en molekylvægt på 2,063.1, som kun passer til A67-R86 af VAMP2 (Supplerende fig. 3). Tilsammen viser disse resultater, at X-LC har et enkelt spaltningssted på VAMP2 mellem R66 og A67.

R66-A67 er et nyt spaltningssted på VAMP2, der adskiller sig fra alle etablerede målsteder for BoNT’er (fig. 2f). Det er også det eneste BoNT-spaltningssted, der er placeret inden for et område, der tidligere var kendt som SNARE-motivet (Fig. 2f, skraverede områder)39. VAMP-proteinfamilien omfatter VAMP1, 2, 3, 4, 5, 7 og 8 samt de beslægtede Sec22b- og Ykt6-proteiner. R66-A67 er bevaret i VAMP1 og 3, som er meget homologe med VAMP2. For at validere X-LC’s specificitet udtrykte vi HA-mærkede VAMP1, 3, 7, 8 og Myc-mærkede Sec22b og Ykt6 i HEK293-celler via transient transfektion. Celle lysater blev inkuberet med X-LC. Både VAMP1 og 3 blev kløvet af X-LC, mens VAMP7, VAMP8 og Sec22b var resistente over for X-LC (Fig. 2g).

BoNT/X kløver VAMP4, VAMP5 og Ykt6

Uventuelt blev Ykt6 også kløvet af X-LC (Fig. 2g). Dette fund blev bekræftet ved hjælp af et oprenset GST-tagget Ykt6-fragment, som skiftede til et bånd med lavere molekylvægt efter inkubation med X-LC (Fig. 2h). Spaltningsstedet blev bestemt til at være K173-S174 ved massespektrometrianalyse af intakt Ykt6 i forhold til Ykt6 spaltet af X-LC (Supplerende figur 4). Dette sted er homologe med spaltningsstedet for BoNT/X på VAMP2 (fig. 2f). Blandt proteinerne i VAMP-familien indeholder VAMP4 det samme par af rester (K87-S88) på dette sted som Ykt6. Vi fandt, at X-LC kløvede både oprenset GST-tagged cytoplasmatisk domæne af VAMP4 (Fig. 2i), såvel som native VAMP4 i BDE (Fig. 2j). Som en kontrol blev Sec22b ikke kløvet af X-LC i BDE. Desuden blev det GST-mærkede cytoplasmatiske domæne af VAMP5 også spaltet (fig. 2i). Kløvningsstederne blev bestemt ved massespektrometrianalyse til at være K87-S88 i VAMP4 og R40-S41 i VAMP5 (Supplerende figur 5). Begge steder er homologe med spaltningsstedet for BoNT/X på VAMP2 (Fig. 2f), hvilket viser, at placeringen af spaltningsstedet er bevaret på tværs af forskellige VAMP’er. X-LC’s evne til at kløve VAMP4, VAMP5 og Ykt6 er meget usædvanlig, da deres sekvenser er væsentligt forskellige fra VAMP1/2/3. BoNT/X er den første og eneste kendte BoNT, der kan kløve VAMPs ud over de kanoniske mål VAMP1, 2 og 3 (ref. 40).

Proteolytisk aktivering af BoNT/X

Vi undersøgte dernæst linkerregionen mellem LC og HC, som skal kløves af bakterielle proteaser eller værtsproteaser for at konvertere toksinet til en “aktiv” di-kædeform. Vi producerede et rekombinant X-LC-HN-fragment (rester 1-891) i E. coli og underkastede det begrænset proteolyse med endoproteinase Lys-C. Prøverne blev analyseret ved hjælp af Tandem Mass Tag-mærkning (TMT) og tandem-massespektrometri. TMT mærker frie N-terminaler (og lysiner). Begrænset proteolyse med Lys-C producerede én ny fri N-terminus, der var kortlagt til rest N439 i linkerregionen (Fig. 3a; Supplerende data 1), hvilket bekræfter, at linkerregionen er modtagelig for proteaser.

(a) Sekvensalignering af linkeren mellem LC og HC i de syv etablerede BoNT’er plus BoNT/X. Lys-C-skæringsstedet blev identificeret ved massespektrometrianalyse (se metode og supplerende data 1). (b) Kulturerede rottekortikale neuroner blev eksponeret for X-LC-HN i 12 timer. Celle-lysater blev høstet, og der blev foretaget immunoblot-analyse for at undersøge syntaxin 1, SNAP-25 og VAMP2. Actin er en belastningskontrol. Trypsin-aktiveret A-LC-HN og B-LC-HN blev analyseret parallelt. X-LC-HN gik ind i neuroner og spaltede VAMP2. X-LC-HN aktiveret af Lys-C viste en større styrke end ikke-aktiveret X-LC-HN. X-LC-HN var mere potent end B-LC-HN og A-LC-HN, hvoraf ingen af dem kløvede deres substrater. (c) WT og mutant X-LC-HN blev aktiveret af Lys-C og analyseret ved SDS-PAGE og farvning med Coomassie Blue, med eller uden DTT. C461S- og C467S-mutanterne viste sig som et enkelt bånd på ∼100 kDa uden DTT og adskilt i to ∼50 kDa-bånd med DTT. En del af WT X-LC-HN dannede aggregater, markeret med en asterisk, som forsvandt med DTT. Størstedelen af aktiveret WT X-LC-HN blev adskilt i to ∼50 kDa-bånd uden DTT. Dette skyldes disulfidbindingsomlægning som beskrevet i det følgende panel. (d) Lys-C-aktiveret WT X-LC-HN blev inkuberet med NEM for at blokere disulfidbindings-shuffling. Prøverne blev derefter analyseret ved SDS-PAGE og farvning med Coomassie Blue. Størstedelen af WT X-LC-HN findes som et enkelt bånd ved ∼100 kDa uden DTT efter NEM-behandling, hvilket indikerer, at den native WT X-LC-HN indeholder en disulfidbinding mellem kæderne. (e) Skematiske tegninger af disulfidbindingen i WT og tre cysteinmutanter af BoNT/X. (f) Eksperimenter blev udført som beskrevet i b, bortset fra at neuroner blev eksponeret for WT- eller X-LC-HN-mutanter. C423S-mutationen ophævede aktiviteten af X-LC-HN, mens mutation af C461 eller C467 ikke påvirkede aktiviteten af X-LC-HN. Disse resultater bekræftede, at disulfidbindingen mellem kæderne er afgørende for aktiviteten af X-LC-HN, og at denne disulfidbinding mellem kæderne kan dannes enten via C423-C461 eller C423-C467. Et af to (b) eller tre (b,c,f) uafhængige eksperimenter er vist.

Vi undersøgte derefter, om proteolytisk aktivering øger BoNT/X’s styrke. Det er blevet vist, at inkubation af høje koncentrationer af LC-HN af BoNT’er med dyrkede neuroner resulterer i indgang af LC-HN, sandsynligvis gennem uspecifik optag i neuroner41. På samme måde trængte X-LC-HN ind i dyrkede rottekortikale neuroner og spaltede VAMP2 på en koncentrationsafhængig måde (fig. 3b). Aktivering med Lys-C øgede styrken af X-LC-HN: 10 nM aktiveret X-LC-HN kløvede lignende niveauer af VAMP2 som 150 nM intakt X-LC-HN (Fig. 3b). Aktiveret X-LC-HN synes at være mere potent end aktiveret LC-HN af BoNT/A (A-LC-HN) og BoNT/B (B-LC-HN), som ikke viste nogen påviselig spaltning af deres substrater under de samme assaybetingelser (Fig. 3b).

Disulfidbindingen mellem kæderne i BoNT/X

Som andre BoNT’er indeholder linkerregionen i BoNT/X to bevarede cysteiner, men der er også et ekstra cystein (C461), der er unikt for BoNT/X (fig. 3a). For at bestemme de cysteinrester, der danner den essentielle disulfidbinding mellem kæderne, genererede vi tre X-LC-HN-mutanter, hver med en af de tre cysteinrester muteret (C423S, C461S og C467S). Disse mutanter samt X-LC-HN af wild-type (WT) blev underkastet begrænset proteolyse med Lys-C og derefter analyseret via SDS-PAGE og Coomassie Blue-farvning, med eller uden det reducerende middel dithiothreitol (DTT; Fig. 3c). Mutering af det eneste cystein på LC (C423S) forventes at afskaffe disulfidbindingen mellem kæderne. C423S-mutanten blev konsekvent adskilt i to ∼50 kDa-bånd uden DTT. I modsætning hertil viste både C461S- og C467S-mutanterne sig som et enkelt bånd på 100 kDa i fravær af DTT og adskilte sig i to ∼50 kDa-bånd i tilstedeværelse af DTT. Disse resultater tyder på, at C423 på LC kan danne disulfidbindinger mellem kæderne med enten C461 eller C467 på HC. Vi fandt også, at Lys-C-behandling nedbrød en betydelig del af C423S-mutanten sammenlignet med C461S eller C467S-mutanterne (Fig. 3c, +DTT), hvilket tyder på, at tab af interkædet disulfidbindingen gør molekylet mere modtageligt for proteaser. Vi bemærkede, at en del af WT X-LC-HN dannede aggregater i toppen af SDS-PAGE-gelen (Fig. 3c, markeret med en asterisk). Disse aggregater forsvandt i tilstedeværelse af DTT. C423/C461/C467 er de eneste tre cysteiner i X-LC-HN; ved at mutere en af dem blev dannelsen af aggregater ophævet (Fig. 3c, -DTT), hvilket tyder på, at disse aggregater dannes af intermolekylære disulfidbindinger på grund af eksistensen af et ekstra cystein i linkerregionen.

Interessant nok adskilte størstedelen af aktiveret WT X-LC-HN sig i to ∼50 kDa-bånd uden DTT (Fig. 3c), hvilket svarer til C423S-mutanten. På den anden side viste WT X-LC-HN ikke øget nedbrydning af Lys-C sammenlignet med C423S-mutanten (Fig. 3c, +DTT). En mulig forklaring er, at WT X-LC-HN indeholder en disulfidbinding mellem kæderne under native forhold, men at denne binding kan omarrangere sig til et intrakæde C461-C467-par under denatureringsforhold i SDS-bufferen. Dette fænomen er kendt som disulfidbindings-shuffling, som ofte forekommer blandt tilstødende cysteiner. For at teste denne hypotese anvendte vi et alkylerende reagens, N-Ethylmaleimid (NEM), som permanent blokerer frie cysteiner og forhindrer disulfidbindingssuffling. Som vist i fig. 3d viste WT X-LC-HN, der var forbehandlet med NEM, sig som et enkelt bånd på 100 kDa i fravær af DTT og adskilt i to ∼50 kDa-bånd i tilstedeværelse af DTT. Disse resultater bekræfter, at WT X-LC-HN hovedsageligt indeholder en disulfidbinding mellem kæderne, men den er modtagelig for disulfidbindingssuffling på grund af et ekstra cystein i linkerregionen (Fig. 3e).

Vi undersøgte yderligere aktiviteten af de tre X-LC-HN cysteinmutanter på dyrkede neuroner. Som forventet var C423S-mutanten inaktiv, mens C461S og C467S-mutanterne begge viste lignende aktivitetsniveauer som WT X-LC-HN (Fig. 3f). Disse resultater bekræfter, at disulfidbindingen mellem kæderne er kritisk for aktiviteten af BoNT/X.

Generering af BoNT/X i fuld længde via sortase-medieret ligering

Vi søgte derefter at bestemme, om BoNT/X i fuld længde er et funktionelt toksin. Da der ikke findes antisera mod BoNT/X, besluttede vi at undgå at generere det aktive toksin-gen i fuld længde. I stedet udviklede vi en metode til at generere en begrænset mængde BoNT’er i fuld længde i reagensglas ved enzymatisk ligering af to ikke-toksiske fragmenter af BoNT’er. Denne metode anvender en transpeptidase, kendt som sortase42,43 , som genkender peptidmotivet LPXTG, spalter mellem T-G og samtidig danner en ny peptidbinding med andre proteiner/peptider, der indeholder N-terminal glycin (fig. 4a). Vi fremstillede to ikke-toksiske fragmenter af BoNT/X: (1) LC-HN med et LPETGG-motiv og et His6-tag fused til C-terminus; og (2) HC af BoNT/X (X-HC) med et GST-tag, thrombin-spaltningssted og en ekstra glycinrest ved sin N-terminus. Ved at blive klippet med thrombin frigøres X-HC med en fri glycinrest ved sin N-terminus. Ved inkubation af disse to fragmenter med sortase blev der dannet en lille mængde ∼150 kD BoNT/X i fuld længde (X-FL, fig. 4a,b). Vi bemærker, at X-HC viste dårlig opløselighed og en stærk tendens til aggregering, hvilket kan være årsagen til den lave ligeringseffektivitet (Fig. 4b). I modsætning hertil opnåede ligering af X-LC-HN med HC af BoNT/A (A-HC) en bedre effektivitet, idet størstedelen af X-LC-HN blev ligeret til et XA-chimært toksin (supplerende fig. 6a). For at sikre biosikkerhed er mængden af forløberfragmenter i reaktionen strengt begrænset for at generere den minimale mængde af ligeret toksin, der er nødvendig for funktionelle analyser.

(a) En skematisk tegning af sortase-ligeringsmetoden. (b) Sortase-ligeringsreaktionsblandinger blev analyseret ved SDS-PAGE og farvning med Coomassie Blue. Asterisken markerer proteinaggregaterne som følge af intermolekylære disulfidbindinger. BoNT/X i fuld længde (X-FL) optrådte kun i sortase-ligeringsblandingen. (c) Neuroner udsat for sortase-ligeringsblandingen (15 μl) eller kontrolblandinger i 12 timer i kulturmedium. Celle lysater blev analyseret ved immunoblot. Blandingen, der indeholdt både X-LC-HN og X-HC (men ikke sortase), spaltede lidt mere VAMP2 end X-LC-HN alene. Ligering af X-LC-HN og X-HC med sortase øgede yderligere spaltningen af VAMP2, hvilket viser, at ligeret X-FL er funktionelt på neuroner. (d) BoNT/A-G, BoNT/DC og BoNT/X blev underkastet dot blot-assayet ved hjælp af fire hesteantisera (trivalent anti-BoNT/A, B og E, anti-BoNT/C, anti-BoNT/DC og anti-BoNT/F) samt to gedeantisera (anti-BoNT/G og anti-BoNT/D). BoNT/X er sammensat af X-LC-HN og X-HC i et molforhold på 1:1. Disse antisera genkendte deres tilsvarende måltoksiner, men ingen genkendte BoNT/X. Antisera mod BoNT/DC og BoNT/C krydsreagerer, da disse to toksiner har en høj grad af lighed i deres HC-domæner. (e) Kulturerede rottekortikale neuroner blev udsat for ligeret X-FL i kulturmedium i 12 timer med eller uden to kombinationer af anti-sera. Ab1: trivalent anti-BoNT/A/B/E, anti-BoNT/C og anti-BoNT/F. Ab2: anti-BoNT/G og anti-BoNT/D. Det trivalente anti-BoNT/A/B/E blev anvendt i en fortynding på 1:50. Alle andre anti-sera blev anvendt i en fortynding på 1:100. Ingen af antiseraerne påvirkede spaltningen af VAMP2 og VAMP4 ved X-FL. Specificiteten og styrken af disse antisera blev valideret med hensyn til deres evne til at neutralisere målserotyper i det samme assay som beskrevet i supplerende figur 7. (f) X-FL forbundet ved sortasereaktion (0,5 μg) blev injiceret i gastrocnemius-musklerne i højre baglår af mus (n=4). Det injicerede lem udviklede typisk slap lammelse, og tæerne spredte sig ikke inden for 12 timer. Det venstre lem blev ikke injiceret med toksiner og tjente som kontrol. (g) Den fulde inaktive form af BoNT/X i fuld længde (BoNT/XRY) blev oprenset som et His6-mærket rekombinant protein i E. coli. Yderligere oprenset BoNT/XRY er vist i supplerende fig. 8b. Et af to (e) eller tre (c,d) uafhængige forsøg er vist.

Vi analyserede først aktiviteten af ligeret BoNT/X ved hjælp af dyrkede rottekortikale neuroner. Neuroner blev udsat for sortase-ligeringsblandingen og kontrolblandinger i kulturmedium. Som vist i fig. 4c kløvede X-LC-HN alene en del VAMP2 på grund af dets høje koncentration i reaktionsblandingen. Blanding af X-HC med X-LC-HN uden sortase øgede spaltningen af VAMP2 en smule sammenlignet med X-LC-HN alene, hvilket tyder på, at X-HC kan være associeret med X-LC-HN via ikke-kovalente interaktioner. Denne interaktion synes at være specifik, da blanding af A-HC med X-LC-HN ikke øgede spaltningen af VAMP2 i neuroner (Supplerende figur 6b). Ligering af X-LC-HN med X-HC ved hjælp af sortase øgede klart spaltningen af VAMP2 sammenlignet med blandingen af X-LC-HN og X-HC uden sortase (fig. 4c). Disse resultater viste, at X-HC er funktionelt til målretning af celler, og at ligatureret BoNT/X i fuld længde kom ind i neuroner og kløvede VAMP2. Tilsvarende gik ligeret XA også ind i neuroner og kløvede VAMP2 (Supplerende fig. 6b).

BoNT/X blev ikke genkendt af antisera mod kendte BoNT’er

Vi udførte derefter dot blot-analyser ved hjælp af antisera, der var rejst mod kendte BoNT’er, herunder alle syv serotyper samt et mosaiktoksin (BoNT/DC), for at bekræfte, at BoNT/X er serologisk unik. Der blev anvendt fire hesteantisera (trivalent anti-BoNT/A, B og E, anti-BoNT/C, anti-BoNT/DC og anti-BoNT/F) samt to gedeantisera (anti-BoNT/G og anti-BoNT/D). Specificiteten og styrken af disse antisera blev først valideret ved at analysere deres evne til at neutralisere BoNT’er på dyrkede neuroner. Som forventet neutraliserede alle antisera deres mål-BNT’er uden at påvirke aktiviteten af en anden serotype (supplerende fig. 7). Vi fandt, at disse antisera genkendte deres tilsvarende BoNT’er i dot blot-assayet, men ingen genkendte BoNT/X (fig. 4d).

Vi analyserede yderligere, om BoNT/X’s toksicitet på neuroner kan neutraliseres af disse antisera. X-FL genereret ved sortase-medieret ligering blev først aktiveret med begrænset proteolyse ved hjælp af trypsin. Vi brugte trypsin til at aktivere X-FL i stedet for Lys-C til funktionelle analyser, da trypsin giver os mulighed for at stoppe proteolysen ved hjælp af trypsinininhibitorer. Aktiveret X-FL kom ind i dyrkede rottekortikale neuroner og spaltede både VAMP2 og VAMP4 på en koncentrationsafhængig måde (Fig. 4e). Kombinationer af antisera mod kendte BoNT’er (Ab1 (hesteantisera): trivalent anti-BoNT/A, B og E, anti-BoNT/C og anti-BoNT/F; Ab2 (gedeantisera): anti-BoNT/G og anti-BoNT/D) påvirkede ikke aktiviteten af ligeret X-FL, hvilket fremgik af lignende grader af VAMP2- og VAMP4-spaltning i tilstedeværelsen af disse antisera (Fig. 4e). Disse resultater bekræftede, at BoNT/X er en ny BoNT-serotype.

BoNT/X inducerede slap lammelse in vivo hos mus

Vi forsøgte dernæst at afgøre, om BoNT/X er aktiv in vivo ved hjælp af en veletableret ikke-dødelig test hos mus, kendt som Digit Abduction Score (DAS)-assayet, som måler lokal muskelparalyse efter injektion af BoNT’er i musens baglårsmuskler44. BoNT’er forårsager slap lammelse af lemmernes muskler, hvilket viser sig ved, at det ikke er muligt at sprede tæerne som reaktion på en startle stimulus. Vi injicerede ligeret X-FL (0,5 μg, aktiveret ved trypsinbehandling) i gastrocnemius-musklerne i højre bagkropsled hos mus, hvilket fremkaldte typisk slap lammelse og manglende spredning af tæerne (fig. 4f), hvilket indikerer, at BoNT/X er i stand til at forårsage slap lammelse in vivo. Vi bemærker, at styrken af ligeret X-FL synes at være meget lavere end andre BoNT’er i dette forsøg. For yderligere at bekræfte den lave toksicitet af ligeret X-FL injicerede vi musene med 1 μg ligeret X-FL intraperitonealt (n=3). Ingen mus viste nogen systemiske virkninger, og alle overlevede ved denne dosis. Således har ligeret X-FL en ret lav toksicitet in vivo hos mus sammenlignet med andre native BoNT’er, som normalt har dødelige doser på lave picogramniveauer pr. mus.

Fuld længde inaktivt BoNT/X

Slutteligt udviklede vi en inaktiv mutant af BoNT/X som et potentielt reagens til generering af neutraliserende antistoffer. Mutationer på to rester (R362A/Y365F) i BoNT/A inaktiverer LC’s proteaseaktivitet og ophæver toksiciteten af BoNT/A in vivo45,46. Disse to rester er bevaret i BoNT/X. Vi indførte de tilsvarende mutationer (R360A/Y363F) i BoNT/X og genererede en inaktiv form i fuld længde, der blev betegnet BoNT/XRY. Som vist i fig. 4g blev BoNT/XRY oprenset som et His6-mærket protein i E. coli, og det havde ingen aktivitet på dyrkede neuroner (Supplerende fig. 8a). Desuden forårsagede intraperitoneal injektion af mus med 30 μg BoNT/XRY (aktiveret ved trypsinbehandling) ingen bivirkninger (n=5), hvilket viser, at det ikke er toksisk in vivo. En betydelig del af BoNT/XRY dannede aggregater i toppen af SDS-PAGE-gelen (fig. 4g). Tilsætning af DTT reducerede disse aggregater til monomerisk BoNT/XRY (fig. 4g). BoNT/X i fuld længde er således modtagelig for dannelse af intermolekylære disulfidbindinger. Ikke desto mindre kan den monomere form af BoNT/X oprenses og er stabil i opløsning (fig. 4g). Desuden udviklede vi en opskaleringsprotokol til oprensning, som genererede BoNT/XRY med et udbytte på ∼3 mg pr. liter kultur og ∼90 % renhed (Supplerende figur 8b). Højt oprenset BoNT/XRY forblev stabilt i opløsning op til 10 mg ml-1 i tilstedeværelse af reduktionsmiddel. Denne atoksiske BoNT/XRY vil være et værdifuldt reagens til generering af neutraliserende antistoffer.