Holliday junction

De to veje for homolog rekombination i eukaryoter, der viser dannelsen og opløsningen af Holliday junctions

Holliday junction er et vigtigt mellemled i homolog rekombination, en biologisk proces, der øger den genetiske diversitet ved at flytte gener mellem to kromosomer, samt stedsspecifikke rekombinationsbegivenheder, der involverer integraser. De er desuden involveret i reparation af dobbeltstrengsbrud. Desuden kan der opstå korsformede strukturer, der omfatter Holliday junctions, for at afhjælpe spiralformede spændinger i symmetriske sekvenser i DNA-supercoils. Mens fire-armede junctions også forekommer i funktionelle RNA-molekyler, såsom U1 spliceosomalt RNA og hårnåle-ribozymet fra tobaksringpletvirus, indeholder disse normalt uparrede nukleotider mellem de parrede dobbelthelikale domæner og antager således ikke strengt Holliday-strukturen.

Holliday-junctions i homolog rekombination er mellem identiske eller næsten identiske sekvenser, hvilket fører til et symmetrisk arrangement af sekvenser omkring den centrale junction. Dette giver mulighed for, at der kan ske en grenmigrationsproces, hvor strengene bevæger sig gennem krydsningspunktet. Spaltning eller opløsning af Holliday-knudepunktet kan ske på to måder. Spaltning af det oprindelige sæt af strenge fører til to molekyler, der kan udvise genkonvertering, men ikke kromosomal crossover, mens spaltning af det andet sæt af to strenge medfører, at de resulterende rekombinante molekyler udviser crossover. Alle produkter, uanset spaltning, er heteroduplexer i området for Holliday junction migration.

Mange proteiner er i stand til at genkende eller forvrænge Holliday junction-strukturen. En af disse klasser indeholder junction-opløsende enzymer, der kløver junctionerne, undertiden på en sekvensspecifik måde. Sådanne proteiner forvrænger krydsets struktur på forskellige måder, idet de ofte trækker krydset ind i en ustablet konformation, bryder de centrale basepar og/eller ændrer vinklerne mellem de fire arme. Andre klasser er grenmigrationsproteiner, der øger udvekslingshastigheden med størrelsesordener, og stedspecifikke rekombinaser. Hos prokaryoter falder Holliday junction resolvaser i to familier, integraser og nukleaser, der hver især strukturelt ligner hinanden, selv om deres sekvenser ikke er bevaret.

I eukaryoter er to primære modeller for, hvordan homolog rekombination reparerer dobbeltstrengsbrud i DNA, den dobbeltstrengsbrud-reparationsvej (DSBR) (undertiden kaldet den dobbelte Holliday junction-model) og den synteseafhængige strand annealing (SDSA)-vej. I tilfælde af dobbeltstrengsbrud nedbrydes 3′-enden, og den længere 5′-ende trænger ind i den tilstødende søsterkromatid og danner en replikationsboble. Når denne boble nærmer sig det ødelagte DNA, invaderer den længere 5′-antisense-streng igen sense-strengen af denne del af DNA’et og transskriberer en anden kopi. Når replikationen slutter, forbindes begge haler igen for at danne to Holliday Junctions, som derefter spaltes i en række forskellige mønstre af proteiner. En animation af denne proces kan ses her.

Dobbeltstrengede DNA-brud i bakterier repareres ved hjælp af RecBCD-vejen for homolog rekombination. Brud, der kun opstår på den ene af de to DNA-strenge, kendt som enkeltstrengsbrud, menes at blive repareret af RecF-vejen. Både RecBCD- og RecF-vejene omfatter en række reaktioner, der kaldes branch migration, hvor enkelte DNA-strenge udveksles mellem to krydsede molekyler af duplex-DNA, og resolution, hvor disse to krydsede DNA-molekyler skæres fra hinanden og genoprettes til deres normale dobbeltstrengede tilstand. Homolog rekombination forekommer i flere grupper af vira. I DNA-virus som f.eks. herpesvirus sker rekombination ved hjælp af en break-and-rejoin-mekanisme ligesom i bakterier og eukaryoter. I bakterier lettes grenvandringen af RuvABC-komplekset eller RecG-proteinet, som er molekylære motorer, der bruger energien fra ATP-hydrolyse til at flytte krydsningen. Forgreningen skal derefter opløses i to separate duplexer og genoprette enten forældrekonfigurationen eller en krydset overkonfiguration. Opløsningen kan ske enten horisontalt eller vertikalt under homolog rekombination, hvilket giver patch-produkter (hvis de er i samme retning under reparation af dobbeltstrengsbrud) eller splejseprodukter (hvis de er i forskellige retninger under reparation af dobbeltstrengsbrud). RuvA og RuvB er grenmigrationsproteiner, mens RuvC er et krydsopløsende enzym.

Der er beviser for rekombination i nogle RNA-virus, specielt positiv-sense ssRNA-virus som retrovirus, picornavirus og coronavirus. Der er uenighed om, hvorvidt homolog rekombination forekommer i negative-sense ssRNA-virus som influenza.

OpløsningRediger

I den spirende gær Saccharomyces cerevisiae kan Holliday junctions opløses af fire forskellige veje, der i det væsentlige tegner sig for al opløsning af Holliday junctions in vivo. Den vej, der producerer størstedelen af krydsningerne i S. cerevisiae budding yeast og muligvis også i pattedyr, involverer proteinerne EXO1, MLH1-MLH3 heterodimer (kaldet MutL gamma) og SGS1 (ortolog af Bloom-syndromets helicase). MLH1-MLH3-heterodimeren binder fortrinsvis til Holliday-junktioner. Det er en endonuklease, der laver enkeltstrengsbrud i superoprullet dobbeltstrenget DNA. MLH1-MLH3-heterodimeren fremmer dannelsen af crossover-rekombinanter. Mens de tre andre veje, der involverer proteinerne MUS81-MMS4, SLX1 og YEN1, kan fremme opløsningen af Holliday junctions in vivo, har fravær af alle tre nukleaser kun en beskeden indvirkning på dannelsen af crossover-produkter.

Dobbeltmutanter, der er slettet for både MLH3 (hovedvej) og MMS4 (mindre vej), viste dramatisk reduceret crossing over sammenlignet med wild-type (6- til 17-fold); sporernes levedygtighed var imidlertid rimelig høj (62%), og kromosomal disjunktion syntes for det meste funktionel.

Og selv om MUS81 er en komponent af en mindre crossover-vej i meiosen hos gær, planter og hvirveldyr, synes MUS81 i protozoen Tetrahymena thermophila at være en del af en essentiel, hvis ikke den fremherskende crossover-vej. MUS81-vejen synes også at være den fremherskende crossover-vej i fissionsgæren Schizosaccharomyces pombe.

MSH4- og MSH5-proteinerne danner en hetero-oligomerisk struktur (heterodimer) i gær og mennesker. I gæren Saccharomyces cerevisiae virker MSH4 og MSH5 specifikt for at lette krydsninger mellem homologe kromosomer under meiose. MSH4/MSH5-komplekset binder og stabiliserer dobbelte Holliday-junktioner og fremmer deres opløsning til crossover-produkter. En MSH4-hypomorfe (delvist funktionel) mutant af S. cerevisiae viste en 30 % reduktion af antallet af krydsninger i hele genomet og et stort antal meioser med kromosomer, der ikke udveksler kromosomer. Ikke desto mindre gav denne mutant anledning til sporelevedygtighedsmønstre, der tyder på, at segregation af ikke-udvekslingskromosomer fandt effektivt sted. I S. cerevisiae er korrekt segregation således tilsyneladende ikke helt afhængig af crossovers mellem homologe par.