Guanidin

Membranproteiner

Guanidin og SDS-opløsninger er denaturerende opløsningsmidler, men vi ønskede naturligvis også at karakterisere membranproteinernes native tilstand. Vanskeligheden her var, at der endnu ikke var enighed om, hvordan man skulle definere eller opfatte den native tilstand – hvilket for nybegyndere som os var ensbetydende med usikkerhed, fordi vi ikke havde den form for erfaring, der ville sætte os i stand til at foretage et klogt gæt om, hvilken af de modstridende idéer der sandsynligvis ville vise sig at være korrekt.

Selv fosfolipid-dobbeltlaget, det ene uundværlige begreb for den mest minimale forståelse af cellemembraner, var stadig omstridt, på trods af at det første gang var blevet påvist i røde blodlegemer næsten 50 år tidligere, og at det reelt var den eneste tænkelige opstilling på grundlag af termodynamikken, en direkte konsekvens af Irving Langmuirs klassiske målinger fra 1917 med monolag af amfifile stoffer. Jeg har beskrevet den latterligt langsomme accept af dobbeltlagskonceptet i den mellemliggende periode i min bog Ben Franklin Stilled the Waves . Pointen her er, at der stadig var skepsis, da vi blev involveret i membranforskning.

Og blandt dem, der var overbeviste om lipiddobbeltlaget, var måden, hvorpå proteiner blev inkorporeret i membraner, stadig åben for debat. Nogle, som vores Duke-kollega David Robertson, var tilbageholdende med at tro, at proteiner rent faktisk kunne trænge ind i eller krydse et dobbeltlag. To ret forskellige konceptuelle billeder, taget fra en konference på New York Academy of Sciences i 1972, er vist i figur 3 . Det ene er Robertsons “enhedsmembran” med proteiner helt udenpå. Det andet viser Vanderkooi’s billede af cytokromoxidase-komplekser i mitokondriemembraner: proteinet er placeret mere realistisk, men der er endnu ikke nogen forestilling om forskellige hydrofiliske og hydrofobiske domæner, og hvordan de kan diktere protein-lipid-interaktionen. Senere i samme år 1972 blev det nu konventionelle idealiserede billede af fosfolipidbilayers med fungerende proteiner, der løber hele vejen igennem dem, endelig populariseret af Singer og Nicolsons “fluid mosaik”-model .

Fig. 3. To forskellige konceptuelle billeder af membranproteiner, begge foreslået på det samme møde i New York i 1972 : (a) Robertsons tanke om, at proteinerne ville være asymmetrisk anbragt uden for de to bilagsoverflader; (b) Vanderkoois opfattelse af cytochromoxidase-komplekser i tværsnit.

I laboratoriet var det spændende tider, de mest spændende, jeg kan huske. Vi lærte at bruge godartede detergenter, som i modsætning til SDS kunne opløse membranproteiner uden grov denaturering, i et miljø, der simulerer den native tilstand, men et miljø, hvor de også ville være let tilgængelige for molekylær karakterisering – et fremskridt, som vi til dels blev foregrebet af to sympatiske unge mænd fra Finland, Kai Simons og Ari Helenius .

I praksis var vi stadig mest begrænset til at måle molekylvægt og spørge, hvor mange polypeptidkæder der er pr. molekyle, men de proteiner, som disse spørgsmål drejede sig om, var blevet adskilt fra andre membrankomponenter ved hjælp af detergentbehandling. Det vigtigste er, at mange af proteinerne havde kendte cellulære funktioner, og at vores målinger var relevante for disse funktioner. Jeg har allerede nævnt røde blodlegemer, men det lykkedes os faktisk at dække en række biologisk relevante emner, hvilket i mange tilfælde blev ansporet af de studerendes missionæriske iver. F.eks. kom en fysiologistuderende, Stuart Grefrath, med interesse for neurofysiologi, til vores laboratorium for at opregne polypeptidkæderne i en exciterbar membran – i dette tilfælde fra garfiskens olfaktoriske nerve – og dette førte os til senere involvering med flere andre aktive transportsystemer. (Stuart selv døde desværre som følge af en medfødt hjerte-kar-sygdom, før han kunne indfri sit tidlige løfte med en selvstændig karriere). Cerebral myelin var en anden membran fra nervesystemet, som vi kiggede på .

Også værd at fremhæve to besøgende på laboratoriet, som valgte at arbejde sammen: Neal Robinson, en postdoc, og Leon Visser, som var på sabbatår fra CSIR i Pretoria, Sydafrika). De gjorde et meget flot stykke arbejde med kvantitativt at definere domænestrukturen af cytochrom b5, en slags prototype til at illustrere, hvordan membranproteiner er knyttet til membraner og stadig udfører deres funktion i det tilstødende cytoplasma .

I andre projekter reagerede vi på forespørgsler fra fjerntliggende kolleger. Jeg har allerede nævnt arbejdet sammen med Arthur Karlin om acetylcholinreceptoren fra en elektrisk fisk. Et andet eksempel var bakteriorhodopsin, for hvilket vi foretog målinger i detergentopløsning på foranledning af Walter Stoeckenius fra University of California . Her var der et vigtigt spørgsmål i forbindelse med mekanismen for dette proteins protonpumpeaktivitet: Er det indfødte protein funktionelt set en monomer eller (som nogle data syntes at antyde) er det en trimer? Vores solubiliserede protein var utvivlsomt en monomer, og spektrale beviser viste, at det gennemgik den samme cyklus af molekylære ændringer som i den native membran.

I de fleste tilfælde blev vi ikke selv direkte involveret i forsøget på at gå i tænkeboks for at finde ud af, hvordan receptorer eller pumper eller kanaler fungerede, men vi blev uundgåeligt opmærksomme på, hvad problemerne var. Det var en virkelig berigende oplevelse, en stor forskel fra de dage, hvor serumalbumin og β-lactoglobulin (som vi fik fra kommercielle leverandører) var de primære mål for vores forskning.

For så vidt angår ionpumper, gik vi faktisk ind i fysiologien, for det meste på hypotese- eller teoriniveau; vi lærte at modellere kinetiske skemaer med en computer; vi deltog i relevante konferencer osv. Vores sidste sabbatår – til Max Planck-instituttet i Heidelberg – var vigtigt i denne henseende. Formanden for fysiologiafdelingen på Duke, Ted Johnson, sluttede sig til os ved denne lejlighed, så vi var tre af os i aktivt samarbejde. Ted havde længe været computerentusiast og havde tilsluttet hvert enkelt medlem af fysiologifakultetet til den centrale computerfacilitet i North Carolina Research Triangle, før det blev moderne at bruge afdelingens midler på den måde. I den tid måtte vi skrive vores egne programmer til computeren, hvilket var vanskeligt for mig, men jeg mener, at vi opnåede nogle nyttige resultater, hovedsagelig om kinetiske modeller for pumpecyklussen i den ATP-drevne Na,K-pumpe. Vi arbejdede på uortodokse arbejdstider, herunder i weekender og på helligdage, hvilket nogle gange var til ubehag for vores værter i Heidelberg, som var vant til at slukke for centralvarmen, når laboratoriet skulle være ubesat. Ca. hver tiende dag kørte vi over grænsen til Strasbourg for at spise en gourmetfrokost – ledsaget af Alsace-vine, hvis smag vi har nydt lige siden.