Genomisk differentiering og interkontinental populationsstruktur af myggevektorer Culex pipiens pipiens og Culex pipiens molestus

Uafhængig monofyletisk oprindelse af Culex pipiens pipiens og Culex pipiens molestus

To alternative hypoteser er blevet foreslået for at forklare forskellene i de økologiske og fysiologiske strategier hos Cx. p. pipiens og Cx. p. molestus19. Den ene hypotese forklarer en sådan differentiering som et hurtigt skift i fysiologiske og adfærdsmæssige træk som en tilpasning til et underjordisk miljø, der er forbundet med menneskelige aktiviteter22. I dette scenarie må de lokale populationer af Cx. p. molestus være nært beslægtede med de lokale populationer af Cx. p. pipiens30. I dette scenarie betragtes Cx. p. molestus som en økofysiologisk variant af Cx. p. pipiens. En alternativ hypotese går ud på, at forskellen mellem Cx. p. pipiens og Cx. p. molestus er et resultat af forskellen i deres evolutionære historie. De økologiske og fysiologiske strategier hos Cx. p. molestus kunne først være opstået under det varme klima19. Senere viste en sådan strategi sig at være relevant på grund af de menneskelige aktiviteter, der skabte et underjordisk miljø og dermed spredte Cx. p. molestus over hele verden. Dette scenarie betragter Cx. p. molestus og Cx. p. pipiens som separate evolutionære enheder.

I vores undersøgelse testede vi disse hypoteser ved hjælp af helgenomanalyse af 40 Cx. p. molestus- og Cx. p. pipiens-prøver indsamlet fra fire steder i Eurasien og Nordamerika. Vores resultater afviste hypotesen om en genkomst af Cx. p. molestus fra de lokale populationer af Cx. p. pipiens og støttede i høj grad ideen om en uafhængig monofyletisk oprindelse af både Cx. p. pipiens og Cx. p. molestus fra forskellige kontinenter. NJ- og ML-analyser grupperer separat Cx. p. pipiens og Cx. p. molestus fra Republikken Belarus, Den Kirgisiske Republik og Chicago, IL, USA (Fig. 2, Supplerende figurer 1-3). Tilstedeværelsen af en yderligere hybridklynge dannet af autogene og anautogene feltindsamlede eksemplarer fra Washington, D.C., USA, afspejler mere sandsynligt, at der findes en Cx. pipiens – Cx. quinquefasciatus hybridzone i dette område16. Baseret på genetiske afstande er denne klynge imidlertid meget tættere beslægtet med den eurasiske Cx. p. pipiens end med Cx. p. molestus fra Eurasien og USA (Chicago, IL). Desuden identificerede PCA- (fig. 3) og ADMIXTURE-analyser (fig. 4) to forskellige genetiske klynger, der svarer til Cx. p. pipiens og Cx. p. molestus. I begge tilfælde blev alle eksemplarer fra Washington, D.C. grupperet sammen med Cx. p. pipiens fra andre steder. Fst-værdierne for hele genomet på parvis var meget signifikante for alle sammenligningerne (fig. 5). Vi identificerede ikke nogen specifik region med høj divergens i genomet (Fig. 6). Samlet set var Fst-værdierne meget højere mellem Cx. p. molestus og Cx. p. pipiens end mellem autogene og anautogene prøver af Cx. p. pipiens fra Washington, D.C. Den mest divergerende gruppe, baseret på alle gennemførte analyser, var stammen af Cx. p. pipiens fra Washington, D.C. Den mest divergerende gruppe, baseret på alle gennemførte analyser, var stammen af Cx. p. molestus og Cx. p. pipiens. molestus fra Chicago, IL, hvilket kan forklares ved den meget lave genetiske diversitet af denne stamme forårsaget af dens langvarige kolonisering og mulige flaskehals, som fremskyndede den genetiske drift (Fig. 7)

Samme observationer om den uafhængige monofyletiske oprindelse af Cx. p. molestus og Cx. p. pipiens blev opnået ved hjælp af mikrosatellitanalyse i ~600 prøver af Cx. pipiens-myg fra forskellige steder i verden19. Ved hjælp af proceduren med urodfæstede afstandstræer blev de overjordiske populationer af Cx. p. pipiens og de underjordiske populationer af Cx. p. molestus fra Nord- og Sydeuropa grupperet separat. I lighed med vores undersøgelse dannede de overjordiske populationer af Cx. p. pipiens fra USA en yderligere klynge, hvilket tyder på en mere intens hybridisering mellem medlemmerne af Cx. pipiens-komplekset i Nordamerika. Blandingsanalysen viste tilstedeværelsen af tre store klynger, som svarede til Cx. p. molestus, Cx. p. pipiens og Cx. quinquefasciatus. Sidstnævnte klynge blev i denne undersøgelse kun fundet i prøverne fra USA. I et andet arbejde baseret på AFLP-analyser (amplified fragment length polymorphism) sammenlignedes prøver fra Syd- og Nordeuropa og stammer fra Chicago, IL, USA24 . De nordamerikanske og europæiske populationer, der blev anvendt i denne undersøgelse, viste et lignende ADMIXTURE-mønster i AFLP-genomscanningen. Analysen af COI-generne viste også en monofyletisk oprindelse for Cx. p. pipiens og Cx. p. molestus i Europa, Asien og Afrika26.

Den uafhængige monofyletiske oprindelse og den høje grad af genetisk divergens mellem Cx. p. molestus og Cx. p. pipiens tyder således på, at disse to medlemmer af Cx. pipiens-komplekset repræsenterer særskilte fylogenetiske enheder med en uafhængig udviklingshistorie før den menneskeskabte translokation.

Koncepter for artsdannelse og evolution af Culex pipiens-komplekset

De teoretiske modeller for artsdannelse hos dyr kan opdeles i to hovedgrupper: allopatrisk eller geografisk artsdannelse og sympatrisk eller økologisk artsdannelse. Det første koncept for artsdannelse, som E. Mayr3 har været stærkt fortaler for, går ud på, at begyndende taxa først bliver geografisk isolerede. Denne situation reducerer genstrømmen mellem populationerne og kan føre til akkumulering af mutationer, der forårsager genetisk inkompatibilitet mellem hybriderne. Et alternativt koncept for artsdannelse fremhæver økologiske barrierer mellem de nye taxa som vigtige drivkræfter for evolutionen31. Dette scenarie tager hensyn til udviklingen af reproduktiv isolation mellem populationerne som følge af tilpasning til forskellige miljøer uden geografisk isolation, som normalt finder sted i lyset af genstrømmen. I denne situation bliver hybriderne mellem de begyndende taxa mindre velegnede til miljøet, hvilket fremmer den naturlige selektion af alle egenskaber, der reducerer parring mellem dem. Vi mener, at den samlede diversificering af underarterne Cx. p. pipiens og Cx. p. molestus udgør et slående eksempel på artsdannelse gennem mekanismerne isolation-by-økologi. I vores undersøgelse fastslog Fst-analysen betydelige niveauer af genomisk divergens mellem Cx. p. pipiens og Cx. p. molestus (Fig. 5 og 6) på tværs af hele genomet uden klare øer af artsdannelse. Overraskende nok var differentieringsniveauerne lavere omkring centromererne, sandsynligvis på grund af det lave antal pålidelige SNV’er i disse stærkt repetitive regioner. Differentieringen var ekstremt høj mellem Chicago, IL, USA-stammerne af Cx. p. pipiens og Cx. p. molestus, men var lavere mellem underarterne i de eurasiske myggesamlinger. Samlet set tyder disse observationer på en betydelig begrænsning af genstrømmen mellem underarterne.

Der er beskrevet flere mekanismer til reproduktiv isolation mellem Cx. p. pipiens og Cx. p. molestus17. To af dem er præzygotisk virkende, før befrugtning, og reducerer mulighederne for myggeparring. Den første mekanisme er relateret til larvernes habitatspecialisering: Cx. p. molestus optager kælderrum eller andre underjordiske miljøer, mens Cx. p. pipiens foretrækker åbne vandområder over jorden som yngleplads. Dette mindsker chancerne for, at de to underarter kan mødes og parre sig i de voksne stadier. Den anden isoleringsmekanisme er baseret på forskellene i parringsadfærd mellem Cx. p. molestus og Cx. p. pipiens. Cx. p. molestus-hanner danner normalt homogene sværme nær jorden og kræver begrænset plads til parring17. I modsætning hertil sværmer Cx. p. pipiens-hanner nær løvet ca. 2-3 m over jorden. Eksperimentelle undersøgelser af parringsadfærd i små bure viste, at i krydsninger af hunner og hanner af Cx. p. molestus var parringssuccesen 90 %, mens den hos Cx. p. pipiens kun var 3,3 %32. I krydsninger mellem underarter mellem Cx. p. molestus og Cx. p. pipiens var parringssuccesen også lav og varierede mellem 6,6 % og 10 % afhængigt af underarternes køn. Denne undersøgelse viste, at hunner af begge underarter aktivt undgår at parre sig med hanner fra en alternativ underart. Desuden lykkedes det ikke for Cx. p. pipiens-hunnerne at modtage sæd fra Cx. p. molestus og producerede derfor ingen æg.

To andre reproduktive isoleringsmekanismer, der er beskrevet for Cx. p. pipiens og Cx. p. molestus, er postzygotiske, de virker efter parringen og resulterer i nedsat fitness hos hybriderne. En af mekanismerne er relateret til arven af diapause hos hybrider af Cx. p. molestus og Cx. p. pipiens som et recessivt træk8. F1-hybrider og en betydelig del af F2-hybriderne er ikke i stand til at udvikle diapause og kan ikke overleve under vinterforhold. Denne mekanisme kan måske forklare de højere introgressionsniveauer hos Cx. p. pipiens på sydlige steder19,23,24. Endelig er medlemmerne af Cx. pipiens-komplekset udsat for cytoplasmatisk inkompatibilitet hos hybrider, der er inficeret med forskellige stammer af rickettsiaparasitten Wolbachia pipientis. På trods af cytoplasmatisk introgression af denne parasit gennem hybridisering mellem medlemmerne af Cx. pipiens-komplekset33 kan cytoplasmatisk inkompatibilitet begrænse hybridernes overlevelsesrate betydeligt. F.eks. reducerede W. pipientis-infektion hybridiseringen mellem Cx. pipiens og Cx. quinquefasciatus i Sydafrika betydeligt34. En anden undersøgelse viste, at Cx. p. molestus i eurasiske populationer kun blev inficeret af én stamme af W. pipientis, men Cx. p. pipiens af to forskellige stammer35. Desuden blev de eksemplarer af Cx. p. molestus og Cx. p. pipiens, som vi brugte i vores undersøgelse, inficeret med de samme stammer af W. pipientis i den sydlige del af Den Kirgisiske Republik, men med forskellige stammer i den nordlige del af Republikken Belarus. Det kan således forklare forskellene i introgressionen fra Cx. p. molestus til Cx. p. pipiens, som var mere udtalt i Republikken Belarus end i Den Kirgisiske Republik. Faktisk blev der beskrevet et interessant eksempel på infektiøs artsdannelse i det sydamerikanske Drosophila paulistorum-kompleks. I dette kompleks blev seks halvarter med overlappende geografisk udbredelse reproduktivt isolerede som følge af isolation før og efter parring, der blev udløst af Wolbachiae-infektionen36.

Nyere genomiske undersøgelser, der er udført på forskellige organismer, herunder Drosophila simulans37, Rhagoletis-frugtfluer38,39 og Heliconius-sommerfugle40,41 , giver yderligere beviser for, at økologisk artsdannelse forekommer i naturen. De genomiske mønstre for artsdannelse kan være meget forskellige2 og spænder fra små genomiske øer af artsdannelse40 til betydelige divergensniveauer på tværs af hele genomet. Der blev konstateret udbredt genomisk divergens mellem de begyndende arter Anopheles gambiae og An. coluzzii i An. gambiae-komplekset42. Disse arter blev oprindeligt identificeret på grundlag af forskelle i strukturen af deres ribosomale DNA som S- og M-former43 , men senere blev deres taksonomiske status hævet til artsniveau44. An. gambiae og An. coluzzii menes at udvikle reproduktionsbarrierer i sympatrien som følge af forskellene i deres økologiske præferencer45. An. gambiaes larvestadie er knyttet til små regnbassiner. I modsætning hertil udnytter An. coluzzi vedvarende vandreservoirer i forbindelse med risdyrkning. Selv om barriererne mellem arterne er ufuldstændige46 , har de udviklet forskelle i deres sværmadfærd47,48 og divergerende sangtyper49.

Der er således en høj grad af genomisk divergens, en markant forskel i tilpasning til forskellige økologiske miljøer og tegn på præzygotiske og postzygotiske barrierer for parring, der tyder på, at Cx. p. pipiens og Cx. p. molestus repræsenterer forskellige økologiske enheder, der undergår en begyndende økologisk artsdannelse.

Hybridisering i Culex pipiens-komplekset

Den mest fascinerende observation af medlemmerne af Cx. pipiens-komplekset er, at de på trods af forskelle i økologi, fysiologi, adfærd og geografisk udbredelse stadig kan hybridisere og producere levedygtigt afkom i naturen, hvilket indikerer, at den reproduktive isolation mellem dem ikke er fuldstændig. Vores undersøgelse viste også betydelige hybridiseringsbegivenheder mellem underarterne Cx. p. molestus og Cx. p. pipiens. En sammenligning af hele genomet viste, at de fleste af prøverne af Cx. p. pipiens repræsenterer individer med en vis grad af introgression fra Cx. p. molestus (Fig. 4). Vi observerede stor uoverensstemmelse mellem de nukleare og mitokondrielle fylogenier (fig. 2, 8), hvilket indikerer, at der historisk set kan ske overførsel af mitokondrielle genomer mellem underarterne. Samtidig observerede vi ikke haplogrupper, der deles mellem de lokale populationer af underarterne. På kontinenterne var alle de mitokondrielle fylogenier stærkt monofyletiske, hvilket peger på hanformet spredning og hybridisering. Blandingen med Cx. p. molestus var højere i de sydlige populationer af Cx. p. pipiens i Den Kirgisiske Republik og i Washington, D.C., USA, men lavere i de nordlige populationer i Republikken Belarus og Chicago, IL, USA. Dette kan hænge sammen med, at hybriderne ikke er i stand til at udvikle diapause i koldt klima. Til sammenligning afslørede mikrosatellitanalyser et beskedent niveau af hybridisering mellem Cx. p. pipiens og Cx. p. molestus på ~8 % i de nordlige byer i USA (Chicago, IL og New York, NY)30,50. I Sydeuropa, hvor Cx. p. pipiens og Cx. p. molestus begge kunne findes over jorden, var hybridiseringsniveauet mellem disse to arter tilsvarende og blev anslået til 8-10 %51. Der blev fundet langt højere niveauer af hybridisering i sydlige populationer i det østlige USA, hvor ~40 % af alle prøver blev identificeret som hybrider mellem Cx. p. molestus og Cx. p. pipiens19. De samlede hybridiseringsrater mellem medlemmerne af Cx. pipiens var således højere i Nordamerika end i den gamle verden. Til sammenligning varierede hybridisering mellem kryptiske arter i An. gambiae-komplekset (An. gambiae og An. coluzzi) signifikant mellem 1 % i Mali46 til >20 % i Guinea Bissau52 , hvilket kan sammenlignes med de samlede hybridiseringsniveauer mellem Cx. p. molestus og Cx. p. pipiens.

Intrigant nok fandt vi i vores undersøgelse ikke en Cx. p. pipiens-blandingssignatur i nogen Cx. p. molestus-prøver fra Republikken Belarus, Den Kirgisiske Republik og Chicago, IL, USA (Fig. 4). Disse resultater viser en meget begrænset eller ingen genstrøm fra Cx. p. pipiens til Cx. p. molestus. Lignende resultater af asymmetrisk introgression fra Cx. p. molestus til Cx. p. pipiens er blevet påvist i tidligere undersøgelser20,51 . Mekanismen for asymmetrisk introgression er i øjeblikket ukendt. En hypotese går ud på, at hanner af Cx. p. molestus, som kan parre sig på trange steder, kan hybridisere med både Cx. p. molestus- og Cx. p. pipiens-hunner. I modsætning hertil kan Cx. p. pipiens-hanner, som kræver plads til at sværme, er mere tilbøjelige til at parre sig med Cx. p. pipiens-hunner51. Der er dog behov for flere populationsgenetiske og eksperimentelle undersøgelser for at forklare dette fænomen.

Endeligt viste vores undersøgelse, at Cx. p. pipiens kan udvikle autogeni som følge af adaptiv introgression af det genetiske materiale fra Cx. p. molestus. I de i marken indsamlede prøver fra overjordiske og underjordiske miljøer i Washington, D.C., USA, udvalgte vi myg til autogeni. De underjordiske myg var autogene, men de overjordiske myg var anautogene. Myggene fra både autogene og anautogene kolonier dannede imidlertid en enkelt klynge, da naboforbindelsesanalysen blev anvendt (Fig. 2). Desuden klynger PCA (fig. 3) og ADMIXTURE (fig. 4) disse prøver sammen med Cx. p. pipiens fra andre lokaliteter. Der blev fundet populationer med blandede karakteristika i Europa51 og i USA53. I Portugal blev der også fundet et usædvanligt mønster af blodfodringsadfærd på fugle hos Cx. p. molestus54.

Da tilstedeværelsen af igangværende hybridisering mellem medlemmer af Cx. pipiens-komplekset tyder således på, at artsdannelsesprocessen mellem dem ikke er afsluttet, og at postzygotiske barrierer for reproduktiv isolation ikke er fuldt ud dannet. Samlet set mener vi, at medlemmerne af Cx. pipiens-komplekset udgør en bemærkelsesværdig model til undersøgelse af forskellige aspekter af geografisk og økologisk artsdannelse i lyset af den igangværende genstrøm mellem dem og lokale tilpasninger til forskellige miljøer.