Gelfiltreringskromatografi

Gelfiltreringskromatografi Anvendelser

Gelfiltreringskromatografi, en type kromatografi med størrelseseksklusion, kan anvendes til enten at fraktionere molekyler og komplekser i en prøve i fraktioner med et bestemt størrelsesområde, til at fjerne alle molekyler større end en bestemt størrelse fra prøven eller til en kombination af begge operationer. Gelfiltreringskromatografi kan anvendes til at adskille forbindelser som f.eks. små molekyler, proteiner, proteinkomplekser, polysaccharider og nukleinsyrer i vandig opløsning. Når der anvendes et organisk opløsningsmiddel som mobil fase, kaldes processen i stedet for gelpermeationskromatografi.

Gelfiltreringskromatografi kan også anvendes til:

• Fraktionering af molekyler og komplekser inden for et forudbestemt størrelsesområde
• Størrelsesanalyse og -bestemmelse
• Fjernelse af store proteiner og komplekser
• Bufferudveksling
• Desaltning
• Fjernelse af små molekyler såsom nukleotider, primere, farvestoffer, og forurenende stoffer
• Bedømmelse af prøvernes renhed
• Separation af bundne fra ubundne radioisotoper

Gelfiltreringskromatografimedier til alle ovennævnte anvendelser fås i færdigpakkede gravity flow-kolonner, spin-kolonner, lavtryks- og mellemtrykskromatografikolonner og harpikser i flasker.

Gelfiltreringskomatografimekanisme

I en gelfiltreringskromatografikolonne består den stationære fase af en porøs matrix, og den mobile fase er den buffer, der flyder ind mellem matrixperlerne. Perlerne har et defineret porestørrelsesområde, der er kendt som fraktioneringsområdet. Molekyler og komplekser, der er for store til at trænge ind i porerne, forbliver i den mobile fase og bevæger sig gennem kolonnen i takt med bufferstrømmen. Mindre molekyler og komplekser, der er i stand til at bevæge sig ind i porerne, går ind i den stationære fase og bevæger sig gennem gelfiltreringskolonnen ad en længere vej gennem perlernes porer.

Et molekyle eller kompleks, der ligger over fraktioneringsområdet for en bestemt gelfiltreringskromatografikolonne, vil bevæge sig hurtigere gennem kolonnen end et molekyle, der kan komme ind i den stationære fase. Derfor vil enhver bestanddel i prøven, der ligger over fraktioneringsområdet, elueres først (i tomrumsvolumenet) før noget, der ligger inden for fraktioneringsområdet. Den mindste størrelse, der forbliver i den mobile fase og ikke kommer ind i den stationære fase, er kendt som udelukkelsesgrænsen. Bio-Rad tilbyder gelfiltreringskromatografimedier og -kolonner med udelukkelsesgrænser, der spænder over tre størrelsesordener, fra 100 dalton til 100.000 dalton (100 kDa)

Molekyler og komplekser, der kan komme ind i den stationære fase, vil blive fraktioneret i henhold til deres størrelse. Mindre molekyler vil migrere dybt ind i porerne og vil blive forsinket mere end større molekyler, som ikke så let kommer ind i porerne og derfor elueres hurtigere fra kolonnen. Denne forskel i poremigration fører til fraktionering af komponenterne efter størrelse, idet de største elueres først.

I gelfiltreringskromatografikolonner, der er beregnet til afsaltning, bufferudveksling og fjernelse af små molekyler som f.eks. nukleotider, trænger salte og små forbindelser let ind i porerne, forsinkes og migrerer langsommere gennem kolonnen end de større proteiner eller nukleinsyrer. Derfor elueres de interessante komponenter i prøven før salte, nukleotider osv. DNA-oprensningssæt, der anvender denne mekanisme, indeholder ofte spin-kolonner med gelfiltrering.

Opløsning, her defineret som skarpheden af grænserne mellem størrelsesfraktionerne, bestemmes af perlestørrelsen og en række andre faktorer. En mindre perlestørrelse giver generelt en højere opløsning i en gelfiltreringskromatografikolonne. Kompakte molekyler diffunderer hurtigere gennem den stationære fase end lineære molekyler. Størrelseseksklusion, fraktioneringsområde og elueringshastighed påvirkes af buffersammensætning, ionstyrke og pH-værdi. Ved fraktionering af komplekse blandinger af proteiner kan det være nødvendigt at bestemme elueringstider og størrelseseksklusionsgrænser empirisk.

Gelfiltreringskomatografimedier

Et vigtigt kriterium for gelfiltreringskromatografimedier er, at medierne er inerte, og at intet i prøven eller nogen buffer binder sig til medierne. En anden overvejelse er den type gelfiltreringskolonne, der anvendes, og om den anvendes i et kromatografisystem under tryk eller i gravitationsstrøm eller spin-kolonner. Hvis der anvendes et kromatografisystem under tryk, skal både kolonnen og mediet kunne tåle det anvendte tryk og de anvendte strømningshastigheder.

De almindeligt anvendte medier til gelfiltreringskromatografi er baseret på agarose- eller polyacrylamidperler, dextrose til gravitations- eller lavtrykssystemer og polymerharpikser til mellemtrykssystemer. Valget af medie afhænger af egenskaberne ved de komponenter, der skal adskilles, og andre eksperimentelle faktorer. Følgende er generelle overvejelser ved valg af gelfiltreringskromatografimedie:

• Fraktioneringsområde
• Størrelsesudelukkelsesgrænse
• Bedriftstryk
• Flowhastighed
• Prøveviskositet
• pH-område
• Autoklaverbarhed
• Tolerance over for vandblandbare organiske opløsningsmidler; nogle prøver kan være mere opløselige i en vand-organisk blanding
• Tolerance over for vaske- og rengøringsmidler, chaotropiske midler, formamid osv.
• Arbejdstemperatur

Prøvetyperne, valget af medier og opsætningen af kromatografisystemet vil bestemme, hvilke parametre der er de vigtigste for en given rensningsanvendelse.