Gamma-Glutamyl Transpeptidase

Aktivitet og specificitet

Derfor forstås den reaktion, der katalyseres af dette enzym, generelt som overførsel af en γ-glutamylgruppe til en række acceptormolekyler, såsom vand, aminosyrer, dipeptider og γ-glutamyldonor selv, afhængigt af reaktionsbetingelserne. Disse katalytiske egenskaber er forbundet med GGT’s katalytiske mekanisme, hvor reaktionen forløber ved en acylering-deacylering-dobbeltforskydningsmekanisme via et γ-glutamyl-enzym-intermediat.

Som forventet ud fra strukturerne af det naturlige substrat glutathion og dets derivater genkender GGT strengt γ-glutamyldelen, men har en ret bred substratspecificitet med hensyn til den afgående gruppe (Xaa). Glutathion, dets S-konjugater, glutathiondisulfid, γ-glutamyl di- eller tripeptider, glutamin, l-α-methylderivater af γ-glutamylamider, leukotrien C4 og poly-γ-glutamylderivater accepteres alle som substrater . Kunstige substrater såsom l-γ-glutamyl-p-nitroanilid (l-γ-Glu-pNA) og fluorescerende l-γ-glutamyl-7-amino-4-methylcoumarin (l-γ-Glu-AMC) er aktive substrater, der almindeligvis anvendes i tilstedeværelse eller fravær af γ-glutamyl-acceptorer (se nedenfor) til henholdsvis transpeptidase- eller hydrolaseanalyser.

Substratspecificiteten med hensyn til acceptoren er mest udførligt undersøgt med GGT fra rottenyrer . Isomererne af neutrale aminosyrer såsom l-cystin, l-Gln, l-Met, l-Ala, l-Cys og l-Ser er gode acceptorer, men hydrofobiske og forgrenede aminosyrer såsom l-Phe, l-Trp, l-Leu, l-Ile og l-Val er ret dårlige substrater. d-Aminosyrer og α-substituerede aminosyrer fungerer ikke som acceptorsubstrater. Derfor er brugen af d-γ-Glu-pNA en bekvem måde at undertrykke autotranspeptidation ved måling af hydrolaseaktivitet . Da acceptorbindingsstedet overlapper med subsiderne for Cys-Gly-delen af glutathion, foretrækker enzymet dipeptider med Gly på C-terminalen såsom l-Met-Gly, l-Gln-Gly, l-Ala-Gly, l-cystinyl-bis-Gly, Gly-Gly og l-Ser-Gly som acceptorsubstrater i aftagende rækkefølge efter relativ aktivitet . Peptider med mere end to aminosyrerester er meget dårlige acceptorer. Km-værdierne for de accepterende aminosyrer og dipeptider er relativt høje og ligger inden for intervallet 0,1 til 5 mM , men Gly-Gly (Km=3 mM) er mest praktisk som acceptorsubstrat for transpeptidaseaktivitet. Høje koncentrationer af acceptormolekyler hæmmer GGT kompetitivt i forhold til γ-glutamyldonoren (γ-Glu-Xaa), sandsynligvis på grund af overlapningen af bindingsstedet for Xaa og det for acceptoren. Substratspecificiteten med hensyn til Cys-subsite afhænger af enzymets oprindelse; E. coli-enzymet foretrækker f.eks. basiske aminosyrer (l-Arg, l-Lys og l-His) og aromatiske aminosyrer (l-Phe, l-Trp og l-DOPA) på dette site . Acceptorspecificiteten skal dog tages med forsigtighed, da den tilsyneladende aktivitet også afhænger af den effektive koncentration af den deprotonerede aminosyre, der er til rådighed ved den pågældende pH-værdi. Den relativt høje aktivitet, der er observeret med Gly-Gly, skyldes til dels den lave pKa for dette dipeptid . Deprotonerede aminogrupper i acceptorsubstrater synes at være nødvendige for transpeptidation.

Det mest anvendte donorsubstrat til enzymassagning er l-γ-Glu-pNA. En typisk assayblanding til transpeptidaseaktivitet af enzym fra rottenyrer består af 5 mM l-γ-Glu-pNA, 100 mM Gly-Gly i 0,1 M Tris-HCl (pH 8,0) ved 25 °C. Tilsætning af en tilstrækkelig koncentration af Gly-Gly undertrykker effektivt hydrolysen og autotranspeptideringen. Den optimale pH-værdi for GGT er ca. 7,5-9 for transpeptidation, men pH-afhængigheden er meget mindre for hydrolyse . Dette er i overensstemmelse med det faktum, at den tilsyneladende transpeptidaseaktivitet til dels afhænger af den effektive koncentration af acceptorernes frie aminogruppe .

Hydrolaseaktiviteten for glutamin øges op til 12 gange ved at tilsætte acceptor-stedrettede modulatorer såsom maleat, hippurat og glycocholat. Tilsætning af disse forbindelser hæmmer bindingen af acceptorsubstrater og de γ-glutamyldonorer, der besætter Cys-Gly-subsitterne. Tilsætning af γ-glutamyldonorer eller binding af inhibitorer på γ-glutamyldonorstedet øger affiniteten af disse modulatorer, hvilket tyder på kooperative interaktioner mellem bindingsstederne for γ-glutamyldonorer og acceptorer (for en gennemgang se Tate & Meister ). Det acceptorsted, der besættes af disse modulatorer, foreslås at fremme en konformationsændring af GGT til en aktiv form og derved lette dannelsen af en overgangstilstand. Dette foreslås også at forklare stigningen i inaktiveringshastigheden af pattedyrenzymer ved acivicin (vide infra), men dette blev ikke observeret ved hæmning med et γ-monofluorophosphonat, en aktivitetsstedsrettet overgangstilstandsanalog affinitetsmærkning . Acivicin synes at binde til en anden nukleofil rest end den katalytiske nukleofil i pattedyrs GGT .

GGT hæmmes reversibelt og kompetitivt af l- og d-γ-glutamyl-(o-carboxy)phenylhydrazid (anthglutin, produceret af Penicillium oxalicum) med en Ki på 8 μM, og der er ikke rapporteret nogen akut toksicitet for mus . Flere glutamatanaloger med en reaktiv gruppe i nærheden af γ-carboxyen virker som irreversible inhibitorer. 6-Diazo-5-oxo-l-norleucin (DON), O-diazoacetyl-l-serin (l-azaserin) og l-(αS,5S)-α-amino-3-chlor-4,5-dihydro-5-isoxazoleddikesyre (acivicin eller AT-125, produceret af Streptomyces sviceus) er potente, men uspecifikke inaktivatorer af GGT . Acivicin er i vid udstrækning blevet anvendt til at undertrykke GGT-aktiviteten in vivo , selv om acivicin er meget giftigt ved at inaktivere en række glutaminamidotransferaser, der er involveret i biosyntesen af nukleotider, aminosyrer og aminosukkerstoffer . Serin-boratkomplekset er reversibelt bundet til γ-glutamylbindingsstedet for at hæmme GGT med en Ki på 20 μM . Dette klassiske fund har ført til en potent og langsomtbindende inhibitor, l-2-amino-3-boronobutansyre (γ-boroGlu) . GGT hæmmes med en samlet Ki på 17 eller 35 nM, men hæmningen er stadig reversibel. 2-Amino-4-(fluorophosphono)butansyre (γ-PFGlu), en glutamatanalog med en elektrofil fosfor, der erstatter γ-carboxyen, er et effektivt mekanismebaseret og aktivitetsstedsrettet affinitetsmærkningsmiddel for E. coli GGT . Denne forbindelse hæmmer hurtigt og irreversibelt GGT og danner et stabilt, anionisk og tetraedrisk overgangstilstandslignende addukt, som er egnet til peptidkortlægning med henblik på at identificere den katalytiske nukleofil i E. coli GGT (vide infra). En række γ-(monophenyl)phosphono- og γ-phosphonodiester-glutamatanaloger tjener som mekanismebaserede inhibitorer, der hæmmer GGT irreversibelt ved kovalent modifikation af dets katalytiske nukleofil. Især γ-fosfonodiestere, der inkorporerer den strukturelle efterligning af Cys-Gly og dens C-terminale carboxygruppe, udviser usædvanlig høj aktivitet over for human GGT, idet inaktiveringshastigheden er 130 til 6000 gange så hurtig som for acivicin. Hæmningen er selektiv for GGT, og der er ikke observeret nogen toksicitet. En af disse inhibitorer er kommercielt tilgængelig under navnet “GGsTop” (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).

En ikke-glutamatanalog inhibitor af human GGT er fundet ved hjælp af high-throughput screening . Denne forbindelse besætter acceptorstedet i γ-glutamylsubstratkomplekset med en Ki på 17,6 μM. Hæmmeren er artsselektiv, men er reversibel, og der rapporteres om en vis toksicitet.

Den reaktion, der katalyseres af GGT, menes at foregå med en ping-pong-mekanisme via et γ-glutamyl-enzym-intermediat som observeret med serinhydrolaser . Den N-terminale Thr Oγ i den lille underenhed er den katalytiske nukleofil, hvortil en γ-glutamylgruppe er knyttet (se Strukturkemi). Den katalytiske nukleofil i GGT blev for første gang identificeret med E. coli GGT som den N-terminale Thr-residual (Thr391) i den lille underenhed ved peptidkortlægning af enzymet inaktiveret med γ-PFGlu . Denne rest, der svarer til Thr380 (enzymet i rotternes nyre) og Thr381 (det menneskelige enzym), er bevaret blandt alle GGT’er, hvis primære sekvenser er kendt. Den katalytiske nukleofil i human GGT er identificeret som Thr381 ved peptidkortlægning af enzymet inaktiveret med γ-(monophenyl)phosphonoaffinitetsmærket . Den reaktion, der katalyseres af GGT, begynder derfor med det nukleofile angreb fra den N-terminale Thr-rest i den lille underenhed på γ-carboxydelen af et donorsubstrat (γ-Glu-Xaa) for at fjerne Xaa. Det således dannede γ-glutamylenzym reagerer med vand (hydrolyse) eller med aminosyrer og dipeptider (transpeptidation og autotranspeptidation) i det hastighedsbestemmende trin .

GGT er et medlem af de N-terminale nukleofile hydrolaser (Ntn-hydrolaser) som forudsagt ud fra dets unikke fold og modningsprocessen, hvor en aktiv dimer form af modent enzym dannes ved posttranslationel autokatalytisk behandling af den katalytisk inaktive forløber. Dette bekræftes af stedbestemt mutagenese og røntgenstrukturanalyse af bakterielle enzymer (se Strukturkemi).