F-actin

Krystalstruktur af F-actin, 2zwh

Filamentøse actin-enheder (F-actin) kaldes også for mikrofilamenter og er stærkt bevarede, proteinøse komponenter, der findes næsten ubiquitært i eukaryote cytoskeletter. F-actin og andre actinproteiner har generelt strukturelle roller i cellerne.

Indledning

Actin findes i næsten alle eukaryote celler og er primært kendt for sin funktion som struktur- og translokationsprotein. Det har også en ATPasefunktion, da det hydrolyserer ATP til ADP og Pi og undergår konformationsændringer ved hver hydrolyse. Actin tilhører actin-superfamilien, som omfatter andre proteiner såsom Hsp70(DnaK), Hsc70 og hexokinase, på grund af dens nukleotidafhængige konformationsændring. På grund af den lighed, der er observeret i Escherichia Coli’s, Hsc70 og ATPase-domænet af actin, menes det, at de to proteiner har en fælles forfædre. Prokaryoter er ikke kendt for at have actin, men har dog en actinhomolog, MreB, hvilket også fører til tanken om en mulig fælles forfædre.

Actin forekommer i to former: globulært actin (G-actin), de frie monomere enheder af actin, og filamentøst actin (F-actin), som er den polymere form. Disse to former eksisterer i en dynamisk ligevægt med hinanden, idet ATP-associeret polymerisering og depolymerisering sker kontinuerligt i cellen. Monomerenhederne i F-actin besidder en form, der adskiller sig fra den frie monomerform, og det er et resultat af denne ændring, at den mere specifikke ATPaseaktivitet kan observeres.

Assembly

(1J6Z).

G-actin er den frie monomerform af actin, der polymeriseres til F-actin. Strukturen af globulært og filamentøst actin adskiller sig fra hinanden på mange måder, på trods af at G-actin omfatter F-actin. Når det monomere actin bliver polymeriseret til F-actin, bliver enheden fladtrykt. Desuden besidder F-actin en ATPasefunktion, som er minimal i G-actin. Domænerne og det aktive sted er de samme med hensyn til bestanddelene og vil senere blive diskuteret med hensyn til F-actin-monomeren.

G-actin synes at have flere ligander i sin struktur, som ligger uden for det aktive sted. Kun 3 af de 5 menes faktisk at eksistere i opløsning og menes at bidrage til polymeriseringen af G-actin til F-actin. Denne repræsentation af G-actin har også en, som er observeret i nogle krystallinske strukturer af actin, men ikke nødvendigvis. Det observerede molekyle på Cys374, blev brugt til at blokere polymerisationsaktiviteten, så G-actinkrystallen kunne observeres

Formningen af F-actin er en dynamisk proces af samling og adskillelse, som er blevet kaldt “treadmilling”. Overgangen mellem G- og F-actin begynder med en stabiliseret oligomer af ATP-actin-enheder dannet gennem et foldemønster af nukleation-kondensationstypen. Der sker efterfølgende tilsætning af ATP-monomerenheder til begge ender, men på grund af en forskel i ladningspolaritet i de to ender sker der fortrinsvis tilsætning til det, der betegnes som “plus (+)-enden” eller “barbed-end”. I den modsatte ende, den “minus (-) ende” eller den “spidse ende”, sker der fortrinsvis en dissociation af aktinenheder.

Efter fastgørelse af det ATP-bundne actin sker der hydrolyse af ATP, hvorved ADP- og Pi-bunden tilstand fremkommer. Efterfølgende tab af en Pi efterlader ADP-actin-tilstanden. På grund af muligheden for tilføjelse eller fjernelse af monomerenheder i begge ender kan samlingen af F-actin beskrives i form af ligevægt. Men da hastigheden af ATP-actin-associeringen er ti gange så høj som ADP-actin-dissociationen, ser F-actin ud til at bevæge sig fremad, eller “trampe”. ADP-actin-monomerer dissocieres i minus-enden og bliver genanvendt til ATP-actin, så polymerisationen i plus-enden kan finde sted igen.

Struktur

Strukturens historie

F-actinproteinet blev opdaget af Straub i 1942. Strukturen blev spekuleret på baggrund af en røntgenkrystallografi med lav opløsning, der blev fundet i 1990 af Holmes et al. og i løbet af denne tid blev “Holmes-modellen” accepteret. I modsætning hertil er G-actin-strukturen blevet bestemt uafhængigt af hinanden over 30 gange. En F-actin-model med højere opløsning blev først for nylig deponeret i PDB-databasen i december 2008 af Oda et al. .

F-actin Monomer og polymer

(2zwh)

Monomer

Hver F-actin-monomer enhed har, som en del af sin tertiære struktur, flere loops, der er vigtige for dens samling til det polymere F-actin. Disse loops undergår konformationsændringer baseret på tilstanden af det bundne nukleotid, eller de tjener som regioner, som tilstødende monomere actinenheder kan binde sig til. Den fungerer som en “switch” for konformationer, baseret på det bundne nukleotid. De DNAse I-bindende looprester (40-50) gennemgår konformationsændringer, der påvirker stabiliteten, og binder DNAse I-enzymer og formodes at holde DNAse I fast. Den hydrofobiske loop , der spænder over resterne 264-273, og den , der spænder over resterne 165-172, fungerer som steder, hvortil tilstødende D-loops af monomere actin-monomerer kan binde sig. En lignende funktion er bemærket for resterne (374-375).

F-actinmolekylet som vist her består af 375 rester(43kDa) og to ligander, ADP og Ca2+. Det har to hoveddomæner, der er adskilt af en nukleotidbindende kløft. Afhængigt af tilstanden af det bundne nukleotid ændrer F-actins mest stabile konformation sig afhængigt af tilstanden af det bundne nukleotid. I dens ATP- og ADP + Pi-nukleotidbundne tilstand har den en lukket bindingskløft. I den tilstand, hvor det kun er bundet til ADP, har det en bredere bindingskløft Et karakteristisk træk ved actin er, at domænerne forbliver snoet i forhold til hinanden på trods af de nukleotidtilstandsafhængige konformationsændringer.

F-Actin-polymer (baseret på Ken Holmes F-actin-struktur)

Polymer

F-actin har udseende som to højrehåndede helikser, med en gradvis vridning omkring hinanden. Det er i virkeligheden sammensat af gentagelser af 13 actin-enheder for hver 6 venstrehåndede vindinger, der spænder over en længde på 350 Å.

Nukleotid-statusafhængige konformationsændringer

Staten af det bundne phosphorylerede nukleotid påvirker, hvilken konformation F-actin-monomeren påtager sig. Tilstedeværelsen af et gamma-fosfat i det aktive sted forårsager rotation af en Ser14-rest. Denne ændring fører til, at en methyleret histidin (HIC73) bliver forskudt, hvilket ændrer det aktive F-actin-sted og forårsager en konformationsændring i D-loop’en. HIC73 er placeret i “sensor-loop’en” eller “kontakten” til at forbinde ændringer i bundet nukleotid med konformationsændringer. I ATP-actin og ADP-Pi-actin er D-loop’en ustruktureret. I den ADP-bundne form af F-actin er en alfa-helix almindeligvis synlig i monomerens D-loop.

Og selv om alfa-helixen ikke observeres i denne Oda-model af F-actin og ikke ses i nogle andre F-actin-undersøgelser, anerkendes det af Oda et. al, at de eksperimentelle resultater kunne have ført til en udvidet alfa-helix i modellen, i modsætning til en udvidet uordnet streng som det interagerende segment mellem F-actin-monomerenhederne.

Domæner

(2zwh)

Strukturen af en enkelt enhed af F-actin fremkommer af en polypeptidkæde med to domæner. Nukleotidbindingsspalten, som er stedet for ATP-hydrolyse, kan ses mellem de to domæner. Bevægelse af domænerne giver mulighed for åbne og lukkede F-actin-konformationer.

Domænernes bevægelse er muliggjort ved rotation omkring , vist med lilla. Ifølge Oda et al. menes domæne 2 under overgangen fra G- til F-actin at vippe 20° og passe sig selv med domæne 1, hvilket giver en fladere konformation end det frie G-actin. Det er ikke sikkert, om denne affladning sker før eller efter ATP-hydrolyse. Holmes giver et forenklet billede af denne domænebevægelse og udfladning.

Stabilitet

Den fladtrykte foldede form af F-actin kræver andre stabiliseringsmekanismer end den frie monomere G-actin-form. Stabiliteten af F-actin-komplekset opnås ved en række, der involverer argininin 206, 183, 177 (lilla); glutamat 72(blå), aspartat 187(grøn), 179 og 4-methylhistidin 73(gul). Yderligere stabilitet menes at skyldes et brud i interaktionen mellem rester i den samme halvdel af deres respektive domæner til en ny interaktion mellem, hvor der observeres en meget større afstand mellem dem.

Når Pi frigives, resulterer en konformationsændring på D-loop’en i “blødgøring” af F-actinfilamentet. Det vil sige, at det gør ADP-actin-monomeren mere ustabil og gør den mere modtagelig for spaltning

Aktivt sted

Når actin bindes på plusenden af actinfilamentet, aktiveres ATPasefunktionen. Konformationsændringen fra G- til F-actin fremmer den katalytiske aktivitet på grund af det 20°-skift, der fører til et mere lukket bindingssted; denne konformationsændring stabiliseres også af den diagonale subdomæneinteraktion mellem Leu110 og Thr194. Som følge af disse konformationsændringer flyttes actin tættere på ATP-Ca2+-liganden. Gln137 indeholder et vandmolekyle, og placeringen af det tæt på ATP muliggør spaltning af gamma-fosfatet. Frigivelse af det uorganiske fosfat sker via konformationsændringen af den fleksible “D-loop” til en ordnet alfa-helix (dog ikke demonstreret af denne model).

Funktion

F-actin udfører en strukturel, mekanisk og enzymatisk rolle i eukaryote celler. Disse funktioner udelukker ikke nødvendigvis hinanden.

F-actins dynamiske funktioner er stærkt involveret i cellemigration.

Cytoskelet

F-actin er den mest udbredte komponent i cytoskelettet hos eukaryoter. Det giver store mængder trækstyrke i betragtning af dets tynde størrelse. I tilfælde, hvor fleksibiliteten ikke er ønskelig som strukturel komponent, kan der dannes tværbindinger mellem F-actin-polymerer for at give større stivhed og støtte.

Forlængelse af F-actinforgreninger fører til fænomenet med at skubbe plasmamembranen fremad i lamellopodial og filopodial forlængelse. Denne proces er afhængig af den dynamiske ligevægtstilstand, som G- og F-actin eksisterer i, da det er den kontinuerlige polymerisering af actinenheder på forkanten, der driver membranens udvidelse frem. Uden F-actins enzymatiske ATPasefunktion ville denne proces ikke være mulig.

Actin-Myosin

Den relativt fladere form af F-actin sammenlignet med G-actin gør det muligt for myosin at binde F-actin fortrinsvis til F-actin frem for G-actin. Dette betyder, at F-actin og ikke G-actin er den funktionelle form af actin. Det udgør en stor del af de tynde filamenter i forbindelse med myoin, som giver muskelsammentrækninger. F-actins struktur giver det en stor modstandsdygtighed over for omfattende kræfter, som f.eks. dem, der opleves ved muskelsammentrækninger.