EzColocalization: Et ImageJ-plugin til visualisering og måling af kolokalisering i celler og organismer

Oversigt over EzColocalization-arbejdsgangen

Arbejdsgangen for EzColocalization er opdelt i fire moduler med hver sin egen fane på GUI’en. Fanerne er: (i) “Inputs”, hvor billeder, masker eller lister over regioner af interesse (ROI) vælges og justeres; (ii) “Cell Filters”, hvor celler kan vælges ud fra fysiske egenskaber og signalintensitet; (iii) “Visualization”, hvor varmekort, scatterplots og metriske matric matricer (defineret nedenfor) oprettes; og (iv) “Analysis”, hvor kolokaliseringsmetrikker og outputs vælges. Ikke alle moduler og ikke alle processer inden for et modul behøver at blive anvendt. Nogle faner har en “Preview”-knap til at køre et bestemt modul i stedet for knappen “Analyze”, som kører alle valgte processer i alle moduler.

Inputs

Billedfiler, som vælges i fanen “Inputs” (fig. 1A), skal være: (i) monokromatiske (dvs. ikke RGB- eller CMYK-formater); (ii) 8-bit, 16-bit eller 32-bit; og (iii) i et format som TIFF, der bevarer de oprindelige pixelintensitetsværdier. Store billeder kan komprimeres med henblik på filoverførsel ved hjælp af et tabsfrit format som ZIP eller LZW og derefter dekomprimeres med henblik på analyser. Ud over billeder kan EzColocalization acceptere masker og ROI-lister til celleidentifikation (se nedenfor). Hvis der er flere billeder for hver kanal, skal billederne stables for at opnå en mere effektiv analyse i menuen “Stack” (se ImageJ-vejledningen for yderligere oplysninger24). Billeder i en stak kan være forskellige synsfelt eller en tidsserie, men skal have de samme dimensioner, forstørrelse og billedrækkefølge for hver kanal. Indtastningsfanen indeholder også muligheder for at indstille tærskelværdier for signalintensitet og for at justere fejljusterede billeder fra forskellige kanaler (Fig. 1B og Supplerende oplysninger). Anbefalinger til erhvervelse af egnede billeder til kolokaliseringsanalyse findes i de supplerende oplysninger. Bemærk: Justering fungerer ud fra den antagelse, at der kan vælges en passende tærskel for signalintensitet for at skelne pixels inden for og uden for cellerne; hvis tærskelværdien omfatter områder uden for cellen eller kun et begrænset område inden for cellerne, vil justeringen muligvis ikke fungere korrekt. Af denne grund bør alle tilpasninger kontrolleres visuelt ved at undersøge ROI’erne for at bekræfte, at der er valgt passende celleområder.

EzColocalization er primært designet til én “celleidentifikations”-kanal og to eller tre “reporter”-kanalbilleder. Det kan dog fungere med andre inputkombinationer (tabel S1). Celleidentifikationskanalen bruges til at identificere individuelle celler og følgelig til at skelne intracellulære og ekstracellulære pixels. Celleidentifikationskanalen kan være enhver type billede, der gør det muligt at identificere cellegrænserne, herunder: lysmikroskopibilleder (f.eks. fasekontrast25,26 og bright-field), billeder med en reporter, der mærker cellemembranen, eller som er i hele cytoplasmaet (f.eks. Cy5, fig. 1B), og billeder med et ekstracellulært farvestof, der afgrænser cellerne. DIC-billeder (Differential Interference Contrast) skaber skygger, som gør det vanskeligt at foretage en automatisk udvælgelse af celler ved hjælp af tærskelmetoder27; for DIC-billeder anbefaler vi derfor, at der oprettes ROI’er ved hjælp af “udvælgelsesværktøjerne” i ImageJ til manuelt at afgrænse celleområder og derefter tilføje dem til en liste ved at vælge “Add to Manager” (i undermenuen “Selection” i menuen “Edit”). Når ROI’erne for alle celler af interesse i et billede er valgt, kan der oprettes en binær maske ved hjælp af funktionerne “Clear Outside” og “Autothreshold” i ImageJ.

Cell Filters

Fanen “Cell Filters” bruges til at hjælpe med at vælge celler i billeder (fig. 2A) og skelne mellem intracellulære og ekstracellulære pixels. Celler identificeres ved: (i) vælge en af ImageJ’s tærskelalgoritmer24 eller manuelt vælge tærsklerne (hvilket gøres ved at vælge “*Manual*” fra en rulleliste i fanen Inputs og trykke på knappen “Show threshold(s)”), for at identificere regioner, der svarer til celler i celleidentifikationskanalen (Fig. 2B); ii) anvendelse af vandskedesegmentering til at adskille berørende objekter i billederne fra celleidentifikationskanalen (valgfrit) (fig. 2B); iii) udvælgelse af objekter fra billederne fra celleidentifikationskanalen på grundlag af fysiske parametre (fig. 2C) og signalintensitet (fig. 2D). EzColocalization vil forsøge automatisk at registrere, om inputbillederne har mørk eller lys baggrund ved hjælp af skævhed. Hvis man antager, at der er flere pixels i baggrunden end i cellerne, angiver et billede med positiv skævhed en mørk baggrund, og negativ skævhed angiver en lys baggrund. Brugerne kan også manuelt vælge, om inputbillederne har mørk eller lys baggrund i “Parametre…”-indstillingerne i menuen “Indstillinger”. Celler, der kun er delvist inden for et billede, og som derfor kan give misvisende værdier, fjernes automatisk fra analyserne.

EzColocalization har et valgfrit “Pre-watershed filter” og otte valgfrie post-watershed filtre (med mulighed for at vælge flere). Watershed-segmentering kan hjælpe med adskillelse af delende og rørende celler28 , men den kan også opdele store objekter såsom aggregater af ekstracellulært materiale i mindre fragmenter, der har samme størrelse som celler. For at undgå sidstnævnte kan Pre-watershed-filteret bruges til at udelukke objekter med store områder fra analysen. Knappen Preview i fanen Cell Filters (Cellefiltre) giver brugeren mulighed for at se, hvilke objekter på det aktuelle billede der vil blive valgt, når minimums- og maksimumsgrænserne for alle filtrene er justeret. Der er to klasser af parametre for post-watershed cellefiltre (tabel S2): (i) fysiske parametre baseret på målinger fra celleidentifikationskanalen; og (ii) signalintensitetsparametre fra reporterkanalerne. Fysiske parametre gælder for alle kanaler, mens signalintensitetsparametre kun gælder for den reporterkanal, som de er valgt for (fordi reporterne kan have meget forskellige niveauer af signal). Ud over filtrering baseret på foruddefinerede indstillinger i ImageJ har EzColocalization filtre for “MeanBgndRatio” eller “MedianBgndRatio”, som beregnes ved at dividere den gennemsnitlige eller mediane signalintensitet af pixels inde i et objekt med den respektive gennemsnitlige eller mediane signalintensitet af ekstracellulære pixels.

Visualisering

Fanen “Visualisering” viser signaler eller metrikker i celler som: (i) “varmekort”; (ii) spredningsdiagrammer; og (iii) “metriske matric matricer” (Fig. 3A).

Varmekort er pseudofarvebilleder, der viser den relative størrelse af reporter-signaler (Fig. 3B). De genereres ved normalisering og omskalering, således at den mindste og største pixelværdi er henholdsvis 0 og 255 i hver celle, billede eller stak. Der er otte muligheder for farvelægning af varmekortene, og intensitetsværdierne for hver farve fås fra funktionen “Show LUT” (i undermenuen “Color” i menuen “Image” i ImageJ). Cellevarmekort er velegnede til at bestemme, hvor hver reporter forekommer med størst intensitet i cellerne. Billedvarmekort kan vise, om forskellige celler inden for et synsfelt har væsentligt forskellige intensiteter, hvilket kan indikere biologisk heterogenitet eller ujævnheder i mærkningen. Stakvarmekort kan vise, om celler i forskellige billeder har væsentligt forskellige niveauer af signalintensitet, hvilket kan indikere ujævnheder i mærkning eller målinger på tværs af et objektglas (f.eks. på grund af fotoblegning) eller ændringer i signalet over tid (hvis stakken er en tidsserie). Bemærk: Heatmap-udseendet påvirkes af indstillingerne for lysstyrke og kontrast.

Scatterplots viser forholdet mellem signalintensiteten for to eller tre reporterkanaler for individuelle celler og billeder (fig. 3C). Dette forhold er vigtigt ved valg af den passende kolokaliseringsmetrik (Supplerende oplysninger). Scatterplots kan også afsløre heterogenitet i lokaliseringsmønstrene8, hvilket kan kræve fjernelse af baggrundspixels eller separate analyser for forskellige celletyper.

Metriske matric matricer giver et overblik over lokaliseringsmønstre ved at vise de beregnede værdier af en kolokaliseringsmetrik for mange tærskelværdikombinationer. Metriske matric matricer for tærskeloverlapningsscore (TOS) er blevet vist at være nyttige til analyse af lokaliseringsmønstre for to reporterkanaler8,15 (Fig. 3D). For fuldstændighedens skyld har EzColocalization mulighed for at beregne metriske matric matricer for to reporterkanaler ved hjælp af fem andre metricer: tærskeloverlapningsscore med logaritmisk skalering8, Pearson-korrelationskoefficient (PCC), Manders’ kolokaliseringskoefficienter (M1 og M2), Spearmans rangkorrelationskoefficient (SRCC) og intensitetskorrelationskvotient (ICQ)8,15. Kolokalisering for tre kanaler kan også måles ved hjælp af ICQ, Manders’ kolokaliseringskoefficienter og TOS29 (Supplerende oplysninger).

Tærskler for alle målepunkter måles som den øverste percentil (FT) af pixels for signalintensitet8,15. FT = 0,1 er f.eks. de 10 % af pixels med det højeste signal. For de metriske matricer anvendes FT også til at angive trinstørrelsen for tærskelkombinationerne. Det vil sige, at FT = 0,1 også vælger tærskelværdier for de 10 %, 20 %, … og 100 % af pixelerne med det højeste signal. Hvis FT ikke deles jævnt i 100, er den resterende procentdel den sidste trinstørrelse. For målinger, der ikke har brug for en tærskelværdi (dvs. PCC, SRCC og ICQ), beregnes værdierne under antagelse af, at kun de pixels, der ligger over tærskelværdierne, findes. I vinduet Metric Matrix er der mulighed for at gemme resultaterne som tekst eller billede, for at ændre FT eller metrisk type, for at se de enkelte cellers metriske værdier som en liste og for at beregne metrikkens gennemsnit, median eller mode for hver tærskelværdikombination. Knappen “Proc” (behandlet) og “Raw” bestemmer, om den liste af data, der vises, kopieres eller gemmes med knapperne “List”, “Copy” eller “Save…”, er henholdsvis gennemsnitsværdien for prøven for hver tærskelkombination (f.eks. medianværdi) eller alle værdier for hver celle i prøven for alle tærskelkombinationer.

Analysis

Fanen “Analysis” har tre underfaneblade (“Analysis Metrics”, “Metrics Info” og “Custom”). Underfanen “Analysis Metrics” har seks metrikker til måling af kolokalisering for to rapportører (fig. 4A) og tre metrikker for tre rapportører (se forrige afsnit). Brugerne kan vælge en tærskel eller ingen tærskel for PCC, SRCC og ICQ. TOS og Manders’ kolokaliseringskoefficienter skal have en tærskelværdi for at blive beregnet. Underfanen Metrics Info indeholder oplysninger og ressourcer om de metrikker, der anvendes i underfanen Analysis Metrics (flere oplysninger findes i Supplerende oplysninger). Tærskler kan vælges ved hjælp af Costes’ metode30 eller manuelt. I underfanebladet Custom (se Supplerende oplysninger for yderligere oplysninger) kan brugerne skrive deres egen kode i JavaTM til analyse af billeder (bemærk: det medfølgende eksempel er til beregning af PCC) (Fig. 4B). Knappen “Compile” tester koden og opretter en midlertidig fil i den midlertidige Java-mappe og viser resultatet af kompileringen med en “Succeeded”- eller “Failed”-mærkning. Hvis det lykkes, læses den kompilerede brugerdefinerede kode til hukommelsen igen og anvendes på de valgte celler.

Opdatet af hver analyse er en tabel, der angiver billedet og et identifikationsnummer for hver celle (fig. 4C), og for hver celle er der angivet værdier for: (i) den valgte metrik; (ii) fysiske parametre; og (iii) gennemsnitlig signalintensitet for hver kanal (hvis valgt). Bemærk: “NaN” i udgangstabellen angiver, at det ikke er lykkedes at beregne en værdi. Brugerne kan også generere oversigtsvinduer (med celletal, gennemsnit, median og standardafvigelse for den valgte metrik) (fig. 4D), histogrammer af metrikværdier (fig. 4E), binære maskebilleder og en liste over ROI’er, der repræsenterer hver celles position og nummer på hvert billede i ROI-manageren. ROI-lister og binære maskebilleder kan gemmes til genanalyse af de samme celler.

Anvendelser af EzColocalization

EzColocalization er designet til at blive brugt på en modulær måde for at lette tilpasningen af analyser til en bred vifte af eksperimenter og forskerbehov. Dette afsnit fokuserer på at demonstrere specifikke værktøjer i EzColocalization til at løse virkelige problemer i forskellige billedsæt.

I den første anvendelse af EzColocalization anvendes billeder af hippocampale neuroner fra rottehippocampus fra Cell Image Library (CIL:8773, 8775-8788, som tilskrives Dieter Brandner og Ginger Withers) til at demonstrere: (i) brugen af en reporterkanal til celleidentifikation, når et eksperiment ikke har separate ikke-reporterbilleder til celleidentifikation; (ii) cellefiltre til udvælgelse af celler; og (iii) visualiseringsværktøjer til valg af metrikker. Arbejdsgangen for analysen er skitseret i fig. 5A. I det første trin blev der oprettet to reporter-billedstakke: en stak med billeder, hvor F-actin er mærket (ved hjælp af et phalloidinpeptid konjugeret til rhodamin), og den anden stak med billeder, hvor tubulin er mærket (ved hjælp af et antistof konjugeret til Alexa 488) (fig. 5B). Interaktionen mellem F-actin og tubulin er vigtig for neuroners vækst og migration31,32. Vi brugte F-actin-billederne til celleidentifikation, fordi det er til stede i alle celler, og fordi det viser cellegrænserne8. Individuelle celler blev udvalgt fra F-actin-billederne ved at anvende en tærskelværdi til at identificere celler24 og bruge et cellefilter til at fjerne celleaffald (bemærk: parameterværdier i Fig. 5A).

Når cellerne var udvalgt, blev intensiteten af reporter-signalerne undersøgt ved hjælp af cellulære varmekort og scatterplots. Vi fandt, at reporterne ikke kolokaliserede ved høje signalniveauer, og der var et komplekst forhold mellem signalintensiteterne (Fig. 5C,D). På grund af sidstnævnte blev lokaliseringen kvantificeret ved hjælp af Manders’ M1 og M2 og TOS (Supplerende oplysninger). M1 og M2 blev evalueret ved tærskelværdier udvalgt efter Costes’ metode for den celle, der er skitseret i Fig. 5B, og værdierne var henholdsvis 0,289 og 0,995. Disse værdier fortolkes normalt som tegn på, at tubulin har høj kolokalisering med F-actin, og at F-actin har lav kolokalisering med tubulin. TOS-værdierne blev evalueret ved at generere en metrisk matrix med median TOS-værdierne. Matrixen viste kolokalisering, antikolokalisering og ikke-kolokalisering ved forskellige tærskelværdier for signalintensiteterne for tubulin og F-actin (Fig. 5E). På steder i celler, hvor F-actin og tubulin har det højeste intensitetssignal (de øverste 10 % af pixels for hver kanal), er median TOS-værdien -0,36 (n = 20). Denne negative værdi indikerer anticolokalisering, hvilket er i overensstemmelse med indtrykket fra varmekort og scatterplots og med andre rapporter8.

I den anden ansøgning blev billeder af Saccharomyces cerevisiae under mitose hentet fra Cell Image Library33 for at demonstrere: (i) celleidentifikation ved hjælp af håndtegnede konturer (til forsøg, hvor automatiserede metoder til celleidentifikation ikke kan anvendes) og (ii) billedjustering. Reporterindgangene var et billede fra en vildtypestamme (“kontrol”; CIL: 13871), der har BFA1-proteinet, som lægger TEM1 på spindelpollegemet, og et billede fra en stamme uden BFA1-proteinet (∆bfa1-deletionsmutant; CIL: 13870). I disse reporterbilleder udtrykte cellerne TEM1-protein fused til GFP, og DNA’et var mærket med DAPI (4′, 6-diamidino-2-phenylindol). TEM1 lokaliseres til spindelpolkroppe under mitose og er involveret i udløsning af exit fra mitose33. Arbejdsgangen er vist i fig. 6A. I denne applikation blev ROI’er manuelt tegnet omkring cellerne ved hjælp af “Freehand”-udvælgelsesværktøjet i ImageJ på DIC-billeder. Binære masker, som blev brugt til at vælge celleområder, blev oprettet ved at vælge ROI’erne og bruge funktionerne “Clear Outside” og derefter “Auto Threshold” i ImageJ24 (fig. 6B). Celleområderne blev brugt til celleidentifikation og til at korrigere tilpasningen mellem DIC-billederne og reporterkanalerne ved hjælp af “Default”-tærskelalgoritmen (Fig. 6C). Efter denne celleidentifikation og billedjustering er billederne nu klar til visualisering og analyse som beskrevet i det foregående eksempel.

I den tredje anvendelse blev billeder af hele voksne Caenorhabditis elegans, der blev opnået fra Broad Bioimage Benchmark Collection (BBBC012v1, M14)34 , brugt til at demonstrere, at: (i) EzColocalization kan analysere kolokalisering i hele organismer; og (ii) “celle”-filtre kan udvælge individuelle organismer baseret på reporter-signalintensitet. Billederne i dette eksempel er fra det samme datasæt, som blev brugt i vores undersøgelse, der beskriver TOS (men det er ikke de samme billeder)8. Arbejdsgangen er vist i fig. 7A. Omrids af individuelle C. elegans blev tegnet i ImageJ på lysfeltbilleder for at skabe ROI’er, og ROI’erne blev tilføjet til ROI-manageren med henblik på “celle”-identifikation. GFP udtrykt fra clec-60-promotoren i den forreste tarm var reporter 1, og mCherry udtrykt fra myo-2-promotoren i svælget, som er et organ ved siden af den forreste tarm35 , var reporter 2. Cellefiltre for fysiske parametre var unødvendige, fordi kun de objekter, der blev anset for at være egnede C. elegans, havde konturer tegnet omkring sig i første omgang. Cellefiltre for signalintensitet var imidlertid nødvendige, fordi nogle C. elegans havde et lavt GFP-signal, muligvis på grund af transgene silencing36,37 (fig. 7B). Efterfølgende visualisering og analyse kan udføres som beskrevet i den første ansøgning.

I den fjerde ansøgning demonstrerer vi analyse af kolokalisering for tre reporterkanaler. Arbejdsgangen var den samme som for to reporterkanaler, bortset fra at “3 reporterkanaler” først blev valgt i hovedmenuen “Settings” (indstillinger) (Fig. 8A). Billeder blev indhentet fra Broad Bioimage Benchmark Collection (BBBC025, Version 1, Image set: 37983, image: p23_s9) af U2OS-knoglekræftceller (n = 66)38. De tre reporterbilleder havde henholdsvis DNA, endoplasmatisk retikulum (ER) og mitokondrier farvet med Hoechst 33342, concanavalin A/Alexa Fluor488-konjugat og MitoTracker Deep Red (øverste række, fig. 8B). Celleidentifikation blev udført med et billede af plasmamembranen mærket med hvedekimagglutinin (WGA)/Alexa Fluor 555-konjugat (øverst til venstre, fig. 8B). Bemærk: på billedet var også Golgi-apparatet og F-actin-netværket mærket38. Plasmamembranen blev sporet ved hjælp af polygonudvælgelsesværktøjet i ImageJ for at skabe ROI’er for de enkelte celler, og ROI-manageren, der indeholdt ROI’erne, blev valgt til celleidentifikation.

Lokaliseringsmønstrene blev visualiseret på samme måde som for to rapportører, bortset fra at: (i) der er tre sæt varmekort for rapportørerne i stedet for to (nederste række, Fig. 8B); og (ii) scatterplots og metriske matric matricer er i tre dimensioner (Fig. 8C-F). Der er mulighed for i fanen Visualisering og fanen Analyse (Fig. 8G) at måle kolokalisering for de tre rapportører ved hjælp af ICQ, TOS eller Manders’ M1-, M2- og M3-metrikker (Fig. 8G). Af de tre metrikker fandt vi, at TOS var den nemmeste at fortolke. TOS har en enkelt værdi til måling af kolokalisering af alle tre reporter-signaler, og det viste tydeligt, at reporter-signalerne for kernen, mitokondrierne og ER overlappede hinanden ved lave tærskler (dvs. ved høje FT-værdier er der kolokalisering; rød farve i fig. 8E) og ikke overlappede hinanden ved høje tærskler (dvs. ved lave FT-værdier er der antikolokalisering; blå farve i fig. 8E). Disse observationer er i overensstemmelse med, at kernen, mitokondrierne og ER-organellerne overlapper hinanden ved deres kanter (hvor signalet fra deres rapportører typisk er lavere) på grund af kendte fysiske interaktioner, men ikke ved deres centre (hvor signalet fra deres rapportører typisk er højere), fordi de er særskilte strukturer i cellerne39,40,41.