Evolutionær analyse af gyrA-genet fra Neisseria meningitidis-bakteriestammer i klonkompleks 4821 indsamlet i Kina mellem 1978 og 2016

Evolutionær analyse af 77 gyrA-nukleotidsekvenser fra CC4821 N.meningitidis-stammer

Syvoghalvfjerds syv de novo gyrA-sekvenser af CC4821 N.meningitidis blev analyseret i forbindelse med 149 offentligt tilgængelige gyrA-sekvenser (anført i tillægstabel 1). Der blev konstrueret et nabosammenføjende fylogenetisk træ med det resulterende datasæt af 226 gyrA-nukleotidsekvenser (fig. 1). Et lignende træ blev opnået ved hjælp af maximum likelihood (ML)-metoden (yderligere figur 1). Nukleotidsekvenserne var signifikant divergerende med en samlet p-afstand på 0,045 (tabel 1). En oversigt over træet viste, at sekvenserne fra CC4821 N.meningitidis-stammer (med rødt i fig. 1) blev fundet på tværs af træet, hvilket viste, at gyrA-genet var relativt divergerende inden for disse stammer.

Naboforbindende fylogenetisk træ af 226 gyrA-gen-sekvenser fra Neisseria-stammer. Stammenavn er angivet som følger: artsnavn-GB ID-stamme-ID-ST-CC-Serogruppe-indsamlingsland-indsamlingsår-indsamlingsår-CIP-resistensfænotype. Manglende oplysninger er angivet med et tomt felt. For eksempel: N.meningitidis-AM889136.1-alpha14-ST53-CC53-cnl-Tyskland-1999 S; Eikenella corrodens-CP034670.1-KCOM3110—-Sydkorea-2017. Sekvensnavne fra CC4821 N.meningitidis-stammer er angivet med rød skrifttype. De 77 sekvenser, der er genereret i denne undersøgelse, er understreget. Sekvenserne fra 9 referencestammer er angivet med en sort prik. Bootstrap-værdier > 70 % er angivet. Bootstrap-værdier < 70 % er angivet i parentes, når det er nødvendigt. De 9 genetiske grupper, der er identificeret i denne undersøgelse, er angivet som lodrette linjer i parentes. CIP-resistensfænotype er angivet med R for resistens, S for følsom og I for intermediær resistensfænotype

Af de 226 analyserede sekvenser blev næsten 62 % af sekvenserne (140) fundet i toppen af træet, uden nogen signifikant bootstrap-værdi (fig. 1). Disse sekvenser var meget homogene med en p-distance på 0,003 (tabel 1). De resterende 86 sekvenser var mere divergerende med en p-afstand på 0,066 i forhold til de sekvenser, der var grupperet i toppen af træet. De fleste af knuderne vedrørende disse 86 sekvenser havde en bootstrap-værdi > 70 %. Desuden var p-afstanden inden for denne gruppe af 86 sekvenser 0,09, hvilket viser, at disse sekvenser var meget divergerende mellem hinanden. Da de vigtigste knuder i træet havde en bootstrap-værdi > 80 %, besluttede vi at tildele sekvenserne vilkårligt til 9 forskellige genetiske grupper (fig. 1; tabel 1). Disse 9 grupper blev også fundet i ML-træet (Yderligere figur 1). GyrA-sekvenserne fra CC4821-stammer blev fundet i 6 af disse genetiske grupper, nemlig gruppe 1, 2, 3, 5, 6 og 8.

Gruppe 1 bestod af 2 sekvenser, N.meningitidis-MK930374-100514-ST4832-CC4821-C-China-2005 og N.subflava-CP031251.1-M18660—-2009. Denne gruppe blev støttet af en bootstrap på 100 %, hvilket tyder på, at disse to sekvenser var meget forskellige fra resten af sekvenserne. Sekvenserne delte 7 aminoændringer (tabel 1, supplerende tabel 2). Den lange gren svarende til N.subflava-CP031251.1-M18660—-2009-sekvensen tydede imidlertid på, at denne sekvens også var signifikant divergerende fra N.meningitidis-MK930374-100514-ST4832-CC4821-C-China-2005, og dette blev bekræftet af en p-afstand på 0,06 mellem disse 2 sekvenser (tabel 1).

Gruppe 2 bestod af 2 sekvenser fra N.meningitidis-stammer indsamlet i Gansu- og Guangxi-provinsen i Kina i 2007 og 2011, nemlig N. meningitidis-KF733178-G1-ST5636-UA-B-China-2007-R og N. meningitidis-KF733178-G1-ST5636-UA-B-China-2007-R og N.meningitidis-MK930446-GX34173-ST9477-CC4821-B-China-2011.

Gruppe 3 bestod af en enkelt sekvens, nemlig N.meningitidis-MK930402-231003-ST12300-CC4821-B-China-2009. Den knude, der svarer til denne sekvens, blev understøttet af en bootstrap-værdi på 80 %. Desuden var den laveste parvise p-afstand mellem denne sekvens og de andre analyserede sekvenser 0,032, hvilket viser, at denne sekvens var signifikant divergent i forhold til resten af de analyserede sekvenser (tabel 1).

Gruppe 5 bestod af 26 sekvenser, hovedsagelig fra N.meningitidis, herunder 9 fra CC4821. En undergruppe på 7 sekvenser, der blev understøttet af en bootstrap på 100 %, omfattede 5 sekvenser fra N.lactamica. Det er interessant, at N.meningitidis-MK930398-140901-ST8241-CC4821-B-China-2009 blev grupperet sammen med N.lactamica-sekvenser med en bootstrap på 100 % og en lang gren.

Gruppe 6 bestod af 27 sekvenser fra N.meningitidis (8 af CC4821) og 1 sekvens fra N. cinerea, nemlig N.cinerea-LS483369.1-NCTC10294, som delte en knude med N.meningitidis-KF733132-59-ST7962-CC77-NG-China-2009-R. N.cinerea-sekvensen havde imidlertid en lang gren, hvilket tyder på en betydelig divergens i forhold til N.meningitidis-sekvensen. På grundlag af de foreliggende data syntes sekvenserne fra gruppe 6 at være fra stammer, der var resistente over for CIP. Der var imidlertid ingen unik aminosyresubstitution fælles for disse stammer, hvilket tyder på, at der ikke var nogen fælles markør for disse stammers resistensfænotype (Supplerende tabel 2).

Gruppe 8 indeholdt de fleste af de N.meningitidis-sekvenser (64 %), der blev analyseret i denne rapport. Stammerne blev indsamlet i de sidste 88 år i 13 forskellige lande fra 4 kontinenter. På trods af den betydelige tidsspændvidde og geografiske spredning var disse sekvenser stærkt konserverede med en p-afstand på 0,003. Desuden var disse sekvenser fra stammer fra 68 ST-stammer, 24 CC-stammer, 9 serogrupper, herunder referencestammen 053442. Samlet set viste disse observationer, at gyrA-genet var meget bevaret blandt de fleste N.meningitidis-stammer på trods af forskellige genetiske egenskaber, geografiske steder eller indsamlingstidspunktet.

Analyse af divergens inden for GyrA-proteinet

Aminosyredivergens inden for GyrA-proteinet blev analyseret blandt 129 unikke sekvenser (Supplerende tabel 2). Der blev identificeret to hundrede og halvtreds syv divergerende positioner blandt de 931 aminosyrer, der var med i alignmentet (fig. 2). Selv om disse steder blev fundet på tværs af proteinet, syntes fordelingen af divergenserne ikke at være tilfældig. Faktisk var der to regioner, der var stærkt konserverede, fra positionerne 530 til 620 og en mindre region mellem 300 og 330. Ifølge proteinet fra E.coli svarer den første region til slutningen af det amineterminale domæne og begyndelsen af det carboxyterminale domæne. Den anden region svarer til proteinets tårndomæne baseret på 3D-modelstrukturen (fig. 2).

Aminosyredivergens blandt GyrA-proteinet baseret på 129 unikke sekvenser. Positionerne inden for den 932 aminosyrer lange alignment er angivet på X-aksen. Procentdelen af sekvenser med en bestemt divergerende position er angivet på Y-aksen (venstre side). F.eks. har 58 % af sekvenserne en mutation ved position 91. Divergensplottet blev genereret ud fra den aminosyreforskelstabel, der er vist i tillægstabel 2. Sammenligningen har 10 huller, og antallet af sekvenser med huller er angivet på den højre akse og vist som en sort firkant. Et kort over E.coli GyrA-proteinet med strukturelle og funktionelle domæner er vist nederst til sammenligning. Kortet blev genereret på grundlag af følgende referencer . GyrA-proteinsekvensen af E.coli og N.meningitidis-referencestamme 053442 (GB-ID CP000381) blev sammenlignet (Supplerende tabel 4). Det kendte CIP-resistente sted i E.coli er vist, og de tilsvarende positioner i N.meningitidis er angivet med en blå linje. Det er værd at bemærke, at blandt de 8 resistente steder, der er rapporteret i E.coli, er kun positionerne 83 og 87 divergerende i N.meningitidis (steder 91 og 95)

Af de 257 divergerende positioner var der ingen, der blev delt af alle de analyserede gyrA-sekvenser af CC4821-stammer. Fem steder (91, 417, 665, 210 og 288) var meget divergerende, 40 % eller mere af de 129 sekvenser var muteret ved disse positioner. For eksempel havde 48 % af de 129 sekvenser en muteret rest ved position 417 (fig. 2). En position (91) syntes at være forbundet med CIP-resistens, alle de stammer, der ikke var følsomme over for CIP, var muteret på denne position og havde enten et I eller et F eller et V (Supplerende tabel 2).

Identifikation af potentielle resistensmarkører for CIP

Af de 226 analyserede sekvenser var 174 fra stammer, der var testet for resistens over for CIP (Supplerende tabel 1). Der blev testet 67 stammer i forbindelse med denne undersøgelse. Som nævnt ovenfor var alle de stammer, der ikke var følsomme over for CIP (enten med en resistent fænotype (R i træet) eller en intermediær fænotype (I i træet)), muteret på position 91. Det viste, at en mutation i position 91 var forbundet med resistensmekanismen. Blandt de 67 stammer, der blev testet i denne undersøgelse, var 49 muteret på position 91, men 23 af disse stammer havde en intermediær resistensfænotype. Dette tydede på, at andre positioner kunne være involveret i resistensmekanismen. For at identificere yderligere potentielle markører for resistens blev de 226 stammer yderligere analyseret for hver muteret position. En ændring, som ville blive fundet i resistente stammer (herunder intermediær resistensfænotype), men som ikke blev fundet i nogen følsomme stammer, ville komme i betragtning. For at gøre analysen mere stringent blev en mutation, der kun blev fundet i én stamme, imidlertid ikke taget i betragtning. Der blev i alt identificeret 33 steder (supplerende tabel 3; venstre side af supplerende tabel 4). F.eks. blev H8N fundet i 18 resistente stammer (herunder 2 med intermediær fænotype), men ikke i nogen følsomme stammer. Alle 226 stammer blev analyseret for disse 33 positioner. For at øge analysens stringens blev en mutation, der blev fundet i mindst én følsom stamme, endnu en gang udelukket. Mutationen D95N, der blev fundet i resistente og følsomme stammer, blev således ikke taget yderligere i betragtning. I alt blev 39 mutationer (nogle på den samme position som position 91) analyseret (i grønt i venstre side af tillægstabel 4). Der blev udarbejdet en mutationsprofil for de 128 stammer med mindst én mutation af interesse (Supplerende tabel 3). Der blev identificeret 46 forskellige profiler, hvilket betyder, at der var 46 kombinationer af disse 39 mutationer blandt alle de analyserede stammer (højre side af tillægstabel 4). Seksten af de 46 mutationsprofiler vedrørte CC4821-stammer (numre med rødt i supplerende tabel 4). Seksogtyve profiler vedrørte stammer, der vidste sig at være CIP-resistente (stamme-navne med blå skrifttype i supplerende tabel 4). Blandt de 39 potentielle resistente markører var mutationerne N103D og T91I de mest delte i profilerne med henholdsvis 29 og 27 forekomster. Det er dog værd at bemærke, at andre mutationer også var godt repræsenteret som H8N, I111V, E793Q og A679S med henholdsvis 23, 21, 18 og 17 forekomster. Det er også værd at bemærke, at 45 % af de resistente stammer (58 ud af 128) kun havde mutationen T91I. Da resistensmarkører oprindeligt blev beskrevet i E.coli, var det nødvendigt at foretage en sammenligning mellem gyrA-sekvenser af E.coli og referencestammen N.meningitidis 53,442 for at kontrollere disse markørers placering i E.coli-sekvensen (Supplerende tabel 5).

Rekombination inden for gyrA-genet mellem N. spp.

Den fylogenetiske analyse identificerede potentielle rekombinerede individer. For eksempel var gruppe 1 af særlig interesse, der vedrørte N.meningitidis-MK930374-100514-ST4832-CC4821-C-China-2005 og N.subflava-CP031251.1-M18660. Disse to sekvenser delte 7 restændringer, som ikke er set i andre stammer. Desuden blev 5 af disse ændringer set inden for 30 aminosyrer (tabel 1). Endelig blev aminosyreændringer, der blev observeret i den ene stamme, ikke set i den anden stamme, som f.eks. position 740 og 750. Alle disse observationer tyder på en rekombination mellem disse to stammer, hvilket blev bekræftet ved en BootScan-analyse (fig. 3a). Tre andre potentielle rekombinationer blev bekræftet af BootScan. Fig. 3b beskrev en rekombination mellem en CC4821-stamme (sandsynligvis enten N.meningitidis-MK930428-421615-ST10235-CC4821-B-China-2016 eller N.meningitidis-CP000381.1-053442-ST4821-CC4821-C-China-2004_R) og N.cinerea-LS483369.1-NCTC10294 —–. Fig. 3c viste flere rekombinationsbegivenheder mellem N.lactamica-CP031253.1-M17106—– og to N.meningitidis-stammer, N.meningitidis-KJ415206.1-54-R6—– og N.meningitidis-CP000381.1-53,442-ST4821-CC4821-C-China-2004_R. Endelig blev en rekombination mellem N.meningitidis-stammer vist i fig. 3d. Alt i alt viste rekombinationsanalysen, at gyrA-genet i Neisseria-stammer er meget tilbøjeligt til at rekombinere.

Potentielle rekombinationsbegivenheder inter- og intra-arter blandt Neisseria-stammer. a. Rekombination mellem N.subflava og N.meningitidis. Et BootScan-plot blev genereret i SimPlot med N.meningitidis-MK930374-100514-ST4832-CC4821-C-China-2005 som forespørgsel. b. Rekombination mellem N.cinerea og N.meningitidis. Der blev genereret et BootScan-plot i SimPlot med N.meningitidis-KF733132-59-ST7962-CC77-NG-China-2009-R som forespørgsel. c. Rekombination mellem N.lactamica og N.meningitidis. Der blev genereret et BootScan-plot i SimPlot med N.meningitidis-MK930398-140901-ST8241-CC4821-B-China-2009 som forespørgsel. d. Rekombination mellem N.meningitidis-stammer. Der blev genereret et BootScan-plot i SimPlot med N.meningitidis-MK930446-GX34173-ST9477-CC4821-B-China-2011 som forespørgsel. Den stamme, der forudsiges at bidrage mest til rekombinationsprocessen (rygsøjlen), er vist som en rød linje. N.meningitidis-referencestammen 053442 (GB ID CP000381) er vist som en sort linje. Et funktionelt kort for referencestammen 053442 er vist ovenfor på grundlag af det funktionelle kort for E.coli, der er vist i fig. 2