Endoplasmatisk Reticulum-Associeret Nedbrydning (ERAD)

2.1 Proteinfoldningsproces og genkendelse af fejlfoldede proteiner

Omkring 30% af de samlede proteiner og alle transmembranproteiner i cellen syntetiseres i ER, som fungerer som en portal for indgang til den sekretoriske vej via Sec61-kanalen . Ved translokation spaltes den N-terminale hydrofobiske signalsekvens af nyligt syntetiseret protein af et peptidaskompleks . Co- og posttranslationelle modifikationer såsom dannelse af disulfidbindinger, indledende trin af N-glykosylering og glycophosphatidylinositol (GPI)-forankring finder sted i ER.

Det oxiderende miljø i ER fremmer dannelsen af disulfidbindinger, hvilket stabiliserer tertiær proteinstruktur og letter proteinsammensætningen. Under foldningsprocessen dannes disulfidbindinger gennem oxidation af par af frie thioler på cysteinrester af proteindisulfidisomeraser (PDI’er). PDI’er fungerer som cyklusser, og efter den indledende oxidation isomeriseres disulfidbindinger undertiden af PDI og ERp57, som er en thioloxidoreduktase, for at stabilisere den korrekte foldning af protein . Omvendt er reduktionen af disulfidbindinger af fejlfoldede proteiner nødvendig for ERAD’s retrotranslokationstrin. PDI muliggør retrotranslokation af simian virüs-40 (SV-40) og koleratoksin . ERdj5, en ER-oxidoreduktase, reducerer disulfidbindinger og interagerer med EDEM (ER-degradation enhancing mannosidase-like protein) og fremskynder også retrotranslokationstrinnet af SV-40 . ERDJ5 regulerer også nedbrydningen af den sygdomsfremkaldende α1-antitrypsin-variant (null Hong Kong) .

Foldningen hjælpes af molekylære chaperoner, der hjælper mod misfoldning og udfoldning. Chaperonlignende glykaner binder sig til N-glykaner og spiller en afgørende rolle i proteinfoldning og nedbrydning. Det er tydeligt, at N-glykosylering, kvalitetskontrol af proteinfoldning og ERAD er funktionelt forbundet. Efter at være kommet ind i ER bliver langt størstedelen af den nyligt syntetiserede polypeptidkæde N-glykosyleret. Oligosaccharyltransferaseenzymet genkender Asn-X-Ser/Thr-konsensussekvensen i størstedelen af det spirende proteinmolekyle og integrerer kovalent en højmannoseholdig kerneglycangruppe (Glc3Man9GlcNAc2) fra dolichol lokaliseret på ER-membranen til proteinet . På grund af den meget korte halveringstid for den triglycosylerede form af det proteinbundne oligosaccharid begynder glykanbearbejdningen umiddelbart efter overførslen af forløberens glykangrupper gennem glucosidaseenzymer. Efter spaltning af to ud af tre glukoserester kan det spirende protein interagere med kvalitetskontrolle lektiner som CNX og CLR. Denne interaktion er bevaret indtil spaltning af den resterende glukoserest. Efter frigivelse af glykoproteinet fra CNX/CLR-cyklussen klippes den sidste glukose også af, hvorved der dannes uglykosyleret substrat. Dette kompromitterer substratets interaktion med lektin-chaperonerne. På dette stadium kan proteinet, hvis det er korrekt foldet, forlade ER til sin endelige destination. Hvis glycoproteinet imidlertid stadig er ufoldet, bliver det tilbageholdt i ER og reglucosyleret af UDP-glucose:glycoprotein-glucosyltransferase og genopbygges med CNX og CLR, hvilket giver proteinet mere tid til at folde sig korrekt. Man har endnu ikke forstået de mekanismer, der er involveret i afslutningen af reglykosylerings-/deglykosyleringscyklusser. Det er dog klart, at hvis polypeptidkæden ikke kan nå sin modne form efter gentagne foldningsforsøg, fjernes terminale mannoserester fra kerneglykan-kæden gradvist af ER α1,2-mannosidase I (ERMan1). ERMan1 producerer Man8GlcNAc2-isomer ved at fjerne en mannoserest fra den midterste gren af N-glycaner. Ved denne trimning bliver glycoprotein dårligere substrater for reglykosylering og udgang fra CNX-cyklusen .

De hydrofobiske pletter af korrekt foldede proteiner er normalt begravet i det indre af opløselige proteiner. Disse pletter kan imidlertid være eksponeret i fejlfoldede proteiner. Hvis et protein har eksponerede hydrofobiske overflader, binder BiP sig til det for at skjule disse aggregationsfremmende overflader for korrekte foldningsforsøg ved at forhindre aggregering. Hvis foldningen imidlertid ikke lykkes eller forsinkes, tjener en udvidet chaperon-misfoldet proteininteraktion til en sofistikeret proces, hvor proteinet overføres til andre chaperoner og/eller til ERAD-processen .

Det er velkendt, at det første trin i ERAD er udvælgelse af misfoldede proteiner af chaperoner. Allerede i 1999 blev det konstateret, at ERAD-substrater fra gær var markant forskellige i deres krav til den ER-luminale Hsp70, BiP . Nedbrydningen af opløselige substrater såsom pαF og en mutantform af den vakuolære protease carboxypeptidase Y* (CPY*) var afhængig af BiP, mens nedbrydningen af transmembranproteinerne Pdr5*p, Ste6-166p, Sec61-2p og Hmg2p fandt sted på en BiP-uafhængig måde. I 2004 blev det vist, at substrater med cytosolisk domæne som Ste6-166p blev nedbrudt BiP-uafhængigt, mens proteiner med luminal defekt krævede BiP, hvilket tyder på, at afhængigt af topologien af den misfoldede læsion (ER-lumen, ER-membran og cytoplasma) fungerer cytosoliske eller luminale chaperoner ved genkendelse og målretning til nedbrydning .

Det er muligt at studere substratgenkendelse under ERAD ved hjælp af modelmisfoldede proteiner. Det er klart, at de-mannosylering er nødvendig for nedbrydning af misfoldede glykoproteiner, da hæmning af denne mannose-trimning stabiliserer misfoldede glykoproteiner i ER . Overekspression af ERMan1 fremskynder nedbrydningen af N-glykosylerede proteiner . Det resulterende Man8-GlcNAc2-holdige glykoprotein efter denne trimning bliver et substrat for EDEM1 (ER-degradation enhancing mannosidase-like protein 1, Htm1p i gær) – et mannosidase-relateret lektin i ER. Det blev endvidere foreslået, at fejlfoldede glykoproteiner interagerer med ERManI og EDEM1 for deres ERAD, og lektin-kulhydratinteraktion viste sig at være afgørende for EDEM-substratgenkendelse . Selv om ERMan1 blev foreslået som en biologisk timer, der initierer ERAD af misfoldede proteiner, viste nyere undersøgelser, at mannosidaser ikke alene er ansvarlige for intensiv demannosylering under ERAD, især under ikke-basale forhold. Under ER-stressbetingelser (ufoldet proteinrespons aktivt) øger transkriptionel forhøjelse af EDEM1 ERAD-effektiviteten ved at undertrykke proteolytisk nedregulering af ERMan1 . Det viste sig, at EDEM’er også spiller en vigtig rolle i demannosylering af substrater . EDEM1 forhindrer også reglykosylering og fremmer retrotranslokation og nedbrydning af nogle ERAD-substrater . På den anden side, mens mannosidase homologi domæne (MHD) af Htm1p er nødvendigt for substratbinding, binder pattedyr EDEM1 misfoldede proteiner uafhængigt af MHD-domænet, og derfor kan EDEM1 substratbinding ikke kræve mannose trimning eller endda glykosylering . EDEM1 kan således ud over N-linkede oligosacchariddele af glykoproteiner genkende foldningslæsioner af fejlfoldede proteiner. Sammenfattende er EDEM’er direkte eller indirekte involveret i demannosylering af glykoproteiner og/eller fungerer som receptorer, der binder og målretter mannose-trimmede proteiner til ERAD (figur 1).

Trunkering af terminal mannose fra gren C eksponerer α-terminale α1,6-bundne mannoserester, der fungerer som et genkendelsessignal for ERAD-lektiner såsom OS9 (Yos9 i gær) og XTP3-B (figur 2). Gennem deres mannose-6-fosfatreceptorhomologi (MRH)-domæne genkender begge proteiner primært α1,6-bundet mannose j. Derudover genkender OS-9 også α1,6-bundet mannose e og c .

Flere rapporter tyder på, at faktorer (EDEMs, OS9 og XTP3-B), der er nødvendige for substratgenkendelse og -målretning, befinder sig i supramolekylære komplekser og/eller interagerer med vigtige ERAD-regulatorer . For eksempel interagerer EDEM1 med CNX, modtager substrater fra CNX-cyklus og letter ERAD-substratnedbrydning såsom NHK-α1-antitrypsinmutant . EDEM1 associerer også med komponenterne i ER retrotranslokationsmaskineriet. Det foreslås, at EDEM1 binder fejlfoldede proteiner og bruger sit MHD-domæne til at målrette aberrerende proteiner til det ER-residente glycoprotein SEL1L-protein i Hrd1-SEL1L ubiquitinligase-komplekset . SEL1L er et stillads for flere luminal substratgenkendelsesfaktorer og forbinder dem med Hrd1. OS9 og XTP3-B associerer også med Hrd1-SEL1L-komplekset, som også omfatter BiP og GRP94 . Desuden foreslås det, at XTP3-B forbinder BiP med Hrd1-komplekset . Ifølge en hypotese fungerer disse tre chaperoner (EDEM1, OS9 og XTP3-B) som oligomerer, hvor den ene monomer interagerer med substratet og den anden med Hrd1-SEL1L-komplekset . Desuden interagerer EDEM1 også med Derlins, et transmembranprotein, som er en kandidat til translocon ; desuden er Derlin2 vist at forstærke EDEM1’s interaktion med en cytosolisk AAA-ATPase p97, som kobler ATP-hydrolyse til retrotranslokation af fejlfoldede proteiner .

Det er klart, at substratgenkendelsestrinet i ERAD er en kompliceret mekanisme, hvor flere forskellige enzymer og chaperoner, der har forskellige, men samordnede roller i ERAD, er involveret. Desuden varierer antallet og egenskaberne af de involverede proteiner afhængigt af substraterne. Der er f.eks. blevet foreslået samordnede roller for EDEM, ERdj5 og BiP i nedbrydningen af fejlfoldede proteiner . Efter at have forladt CNX-CLR-cyklussen trimmer EDEM1 yderligere Man8-GlcNAc2-glykanstrukturen, og ERdj5 reducerer disulfatbindinger. Samtidig aktiverer ERdj5 BiP’s ATPase-aktivitet. ADP-bundet BiP binder sig til det fejlfoldede protein og holder det i en retrotranslokationskomponentform, indtil det overføres til retrotranslokationskomplekset .

ERAD er også involveret i kvalitetskontrollen af ikke-glykosylerede proteiner, som er uafhængig af lektinlignende proteiner. Immunoglobulin let kæde (Ig-K-LC), et ikke-glykosyleret ERAD-substrat, nedbrydes på en BiP-afhængig måde. Okuda-Shimizu og Hendershot har karakteriseret en ERAD-vej for dette ikke-glykosylerede BiP-substrat og forskellige proteininteraktionsdynamikker, som ses at spille en rolle i denne proces. Ig-K-LC har to intramolekylære disulfidbindinger, og dets fuldt oxiderede form har ikke mulighed for at passere fra ER til cytoplasmaet. BiP interagerer kun med den delvist oxiderede form af Ig, hvilket forhindrer den fulde oxidation af Ig-K-LC og dermed letter frigivelsen af Ig-K-LC fra ER . Desuden er et transmembranprotein indeholdende et UBL-domæne, homoCys-responsive ER-resident protein (HERP), blevet impliceret som en receptor for ikke-glycosylerede BiP-substrater . HERP interagerer med Derlin1, og det delvist oxiderede Ig-K-LC overføres fra BiP til HERP-Derlin1-Hrd1-komplekset og ledes derefter til proteasomal nedbrydning . Ud over BiP er ERdj5 som disulfidreduktase også angivet til at være vigtig for ERAD af ikke-glykosylerede proteiner . De ikke-glykosylerede substrater, der indfanges af BiP, overføres til ERdj5 med henblik på spaltning af disulfidbindinger. Derefter overføres disse substrater til SEL1L ved hjælp af BiP med henblik på retrotranslokation . Ud over BiP er både OS9 og XTP3-B blevet inddraget i ERAD af ikke-glykosylerede proteiner .