En universel heparinantidot med ubetydelig virkning på fibrin(ogen) og plasmakoagulation

Baggrund og formål

Antikoagulantia spiller en central rolle i behandlingen af tromboemboliske lidelser. Blødning hos kirurgiske patienter, der modtager antikoagulantia, er et stort problem. Antidoter administreres for at modvirke antikoagulation og genoprette normal hæmostase. Hidtil er protaminsulfat (PS), et kationisk polypeptid, den eneste klinisk godkendte antidot for ufraktioneret heparin. PS har toksiske bivirkninger og begrænsninger. PS’s manglende evne til fuldstændigt at reversere hepariner med lav molekylvægt og fondaparinux skyldes dets lave bindingsaffinitet over for disse lægemidler. PS interagerer imidlertid med koagulationsproteiner som fibrinogen og danner aggregater, hvilket fører til kardiovaskulære bivirkninger. For nylig udviklede vi et syntetisk universelt heparinomvendingsmiddel (UHRA) med høj bindingsaffinitet over for hepariner. In vivo-undersøgelser viste, at UHRA fuldstændig reverserer aktiviteten af alle klinisk tilgængelige parenterale antikoagulantia og er ikke-toksisk. Denne undersøgelse har til formål at påvise UHRA’s ikke-toksiske karakter ved at vurdere dets indflydelse på fibrinogen, fibrinklumparkitektur, plasmakoagulation og koagellysis.

Metoder

UHRA blev udviklet ved at inkorporere tertiære aminbaserede heparinbindingsgrupper på en dendritisk hyperforgrenet polyglycerol-affaldsstruktur og dække den med methoxypolyethylenglycolkæder. For at forstå UHRA’s indvirkning på koagulationssystemet blev der udført rekalcificerings- og vævsfaktor (TF)-initierede turbidimetriske plasmakoagulationsassays for at forstå virkningen af UHRA på koagulationssystemet. UHRA’s interaktion med fibrinogen blev undersøgt ved hjælp af fibrinogen-aggregationsassay, fibrin-polymeriseringsassay og spektroskopisk analyse (fluorescens og cirkulær dichroisme (CD)). UHRA’s indflydelse på fibrinklumpens arkitektur blev evalueret ved hjælp af scanningelektronmikroskopi (SEM) UHRA’s neutralisering af antikoagulanter (hepariner) blev undersøgt ved hjælp af fluorogen trombingenerationsassay (TGA) i humant trombocytterigt plasma (PRP). Lysis af TF-induceret plasmaklump indeholdende UHRA eller PS udsat for eksogen vævsplasminogenaktivator (t-PA) blev undersøgt ved turbidimetrisk assay.

Resultater og diskussion

Resultater fra plasma-klumpningsassays viste, at UHRA ikke ændrede koagulationsparametrene sammenlignet med PS (TF initieret forsinkelsestid og maksimal absorbans, kontrol vs UHRA 200 mcg/mL, p=0.21 og 0,16, henholdsvis; forsinkelsestid og maksimal absorbans i rekalcificering, kontrol vs. UHRA 200 mcg/mL, p=0,08 og 0,13, henholdsvis), hvilket tyder på, at UHRA ikke har nogen virkning på koagulationssystemet ved den undersøgte koncentration (figur 1). I modsætning til protamin blev fibrinogenaggregations- og fibrinpolymerisationsassayet ikke påvirket af UHRA over et bredt koncentrationsinterval fra 0,05 mg/mL til 1 mg/mL. Sammen med målinger af tryptofanfluorescensudslukning (figur 2) og målinger af fibrinogens sekundærstruktur bekræfter det, at UHRA ikke interagerer med fibrinogen. Resultaterne er helt forskellige fra PS og andre syntetiske kationiske polymerer, som interagerer med fibrinogen og fremkalder aggregering og konformationsændringer. Fibrinpropper genereret i tilstedeværelse af UHRA (selv ved 0,5 mg/mL) viste lignende struktur og fiberstørrelse forbliver den samme som normale fibrinpropper (kontrol vs. UHRA 0,5 mg/mL-proppen, p= 0,12) (figur 3). På den anden side øgede fibrinpropper dannet i tilstedeværelse af 0,05 mg/mL PS (klinisk dosis) fiberstørrelsen og ændrede proppens struktur dramatisk (kontrol vs. PS 0,05 mg/mL-proppen, p< 0,0001). Vores undersøgelser af plasmaklumplysning i tilstedeværelse af eksogen t-PA viser, at UHRA ikke øgede nedbrydningen af klumpen i modsætning til protamin. UHRA genoprettede trombinniveauet i antikoaguleret PRP (hepariniseret), hvilket viser effektiviteten.

Slutning og betydning

Vores undersøgelser viser, at universel heparinmodgift, UHRA, har en ubetydelig indvirkning på fibrinogen, fibrinpolymerisation, koagelstruktur, koagelnedbrydning og koagulationssystemet, hvilket afslører deres fremragende hæmokompatibilitet sammenlignet med protamin. Vores resultater understøtter, at UHRA kunne være en ideel antidot til at genoprette hæmostase efter invasive kirurgiske indgreb og til at afhjælpe blødningskomplikationer som følge af heparinbaserede antikoagulanter.