ELISpot Assay Princip

ELISpot assays anvender sandwich enzyme-linked immunosorbent assay-teknikken (ELISA). Et monoklonalt eller polyklonalt antistof, der er specifikt for den valgte analysand, er på forhånd belagt på en PVDF-mikroplade (polyvinylidendifluorid) med PVDF-bagside. De behørigt stimulerede celler pipetteres i brøndene, og mikropladen anbringes i et befugtet CO2-inkuberingsapparat ved 37 °C i et bestemt tidsrum. I løbet af denne inkubationsperiode binder det immobiliserede antistof i umiddelbar nærhed af de celler, der udskiller stoffet, den udskældte analysand. Efter vask af eventuelle celler og ubundne stoffer tilsættes et biotinyleret polyklonalt antistof, der er specifikt for den valgte analysand, til brøndene. Efter en vask for at fjerne ubundne biotinylerede antistoffer tilsættes alkalifosfatase konjugeret til streptavidin. Ubundet enzym fjernes efterfølgende ved vask, hvorefter der tilsættes en substratopløsning (BCIP/NBT). Der dannes et blåsort præcipitat, der fremstår som pletter på cytokinlokaliseringsstederne, idet hver enkelt plet repræsenterer en enkelt celle, der udskiller analysanden. Pletterne kan tælles med et automatiseret ELISpot-læsesystem eller manuelt ved hjælp af et stereomikroskop.