Elektroporation og konkurrerende transfektionsmetoder

Ud over den direkte indførelse af gener letter elektroporation den direkte overførsel af plasmider mellem celler eller arter – f.eks. fra bakterier til gær.

Der eksperimenteres fortsat intensivt med brugen af elektroporation til at levere medicin og vacciner direkte til cellerne i levende organismer. Denne artikel fokuserer på ikke-medicinske anvendelser.

Elektroporation bruges oftest til at transficere celler transient, selv om stabil transfektion også er mulig. I den biofarmaceutiske industri muliggør transient transfektion produktion af op til et par gram protein til karakterisering og prækliniske undersøgelser. I denne anvendelse har elektroporation ved hjælp af plasmider vist sig at være pålidelig og forudsigelig. Elektroporation producerer ligeledes stabilt transficerede celler, forudsat at DNA indføres i lineær form ved først at behandle det med et restriktionsenzym.

En teknik blandt mange

Elektroporation er solidt etableret i armamentariet af transfektionsteknikker, der omfatter virale vektorer, kemiske eller reagensbaserede metoder og mekanisk genoverførsel. Virale vektorer er den mest almindelige metode til at frembringe stabilt transficerede celler til fremstilling af terapeutiske proteiner. Virale vektorer giver en meget høj transfektionseffektivitet, men er begrænset med hensyn til længden af det indsatte DNA. Virale vektorer står også over for problemer i forbindelse med biosikkerhed og mutagenese.

Andre mekaniske teknikker som f.eks. mikropræcipitation, mikroinjektion, liposomer, partikelbombardement, sonoporation, laserinduceret porering og perle-transfektion anvendes alle eksperimentelt. Disse mekaniske teknikker har en fællesnævner. De forstyrrer cellemembranerne og giver derved DNA mulighed for at trænge ind i cellen. Nogle metoder – f.eks. “genkanonen” – indebærer, at generne projiceres direkte gennem membranen ind i cytoplasmaet. Herfra kan generne vandre til kernen.

Der findes desuden hybridteknikker, som udnytter mulighederne i mekaniske og kemiske transfektionsmetoder. Der er f.eks. i løbet af det sidste årti udkommet talrige artikler om magnetoinfektion, en transfektionsmetode, der kombinerer kemisk transfektion med mekaniske metoder. Der kan f.eks. anvendes kationiske lipider i kombination med genkanoner eller elektroporatorer. Det meste af litteraturen om magnetoinfektion vedrører levering af gener og terapeutiske molekyler til levende organismer.

Elektroporation har flere fordele: alsidighed (fungerer med alle celletyper), effektivitet, meget lavt DNA-krav og mulighed for at fungere i levende organismer. Ulemperne omfatter potentielle celleskader og den uspecifikke transport af molekyler ind i og ud af cellen.

Men blandt kemiske, mekaniske og virale transfektionsmetoder giver elektroporation alene en rimelig sikkerhed for succes uanset målcellen eller -organismen.

For eksempel er kemisk transformation og elektroporation to førende metoder til at indføre DNA i Escherichia coli. Ved sidstnævnte metode skal bakterierne først gøres “kompetente” ved at fjerne buffersalte for at sikre, at strømmen når frem til cellerne, efterfulgt af påføring af den elektriske impuls ved 0 °C for at mindske skaderne på mikroorganismerne. Kemisk transformation indebærer suspension i CaCl2, som skaber porer, efterfulgt af et varmestød, som får DNA ind i cellerne.

En anden metode anvender kationiske lipider til at åbne cellemembraner. Elektroporation er mindre besværlig og mere effektiv, virker på mere varierede celletyper og egner sig lettere til standardmetoder end kemisk transfektion. Nogle forskere foretrækker dog kemisk transformation, fordi den ikke kræver indkøb af et instrument.

Mulighed for innovation

Selv om elektroporation først blev beskrevet i 1965, åbner elektroporation fortsat veje til innovativ videnskab med hensyn til instrumentering, protokoller og eksperimenter. Mindst et dusin universitetsgrupper har udviklet elektroporationsapparater baseret på mikroelektromekaniske systemer (MEMS). En af fordelene ved mikrokanalanordninger er, at de kan konstrueres til ikke at anvende mere spænding end den, der er tilstrækkelig til at opnå en rimelig inkorporering af makromolekyler. Denne fordel er også en ulempe. I modsætning til kommercielle elektroporationssystemer fungerer chipsene ikke med alle celler.

En gruppe ved Department of Biomedical Engineering, Louisiana Tech University under ledelse af Shengnian Wang, Ph.D., har fundet ud af, at guldnanopartikler forbedrer ydeevnen af kommercielt elektroporationsudstyr.1 Wang mener, at partiklerne, som er meget ledende, reducerer cellemediets ledningsevne og samtidig fungerer som “virtuelle mikroelektroder”, der hjælper med at åbne fosfolipidmembraner. Han hævder, at der er tale om forbedret ydeevne (forbedret effektivitet i forbindelse med DNA-levering) og højere celleviabilitet i kraft af lavere porationsspændinger.

Forskere ved Charité Universitätsmedizin Berlin2 har udviklet en kombineret kvadratpuls-elektroporationsstrategi med henblik på reproducerbar transfektion af celler. Britta Siegmund, M.D., og medarbejdere suspenderer celler i buffer og udsætter dem for en indledende højspændingspuls efterfulgt af en lavspændingspuls med forskellig elektrisk og tidsmæssig værdi. Dr. Siegmund hævder, at levedygtigheden er sammenlignelig med standard elektroporation, og at transfektionseffektiviteten er op til 95 %. Hun konkluderer, at teknikken kan “let tilpasses til celler, der anses for vanskelige at transficere.”

Ud over den almindelige DNA-overførsel er transfektion blevet anvendt til at indføre interfererende RNA i forskellige celletyper. Teknikken gør det muligt at foretage kontrollerede undersøgelser i lille skala af dosering og leveringseffektivitet. Problemer med dosering og levering har vanskeliggjort praktiske anvendelser af RNA-interferens i terapi. Men mindst én undersøgelse har sat spørgsmålstegn ved, om RNA-interferensgener indarbejdes mest effektivt ved hjælp af transfektionsreagenser eller elektroporation i primære celler.3

Kirsty Jensen, Ph.D., og kolleger ved University of Edinburgh sammenlignede effektiviteten af 11 kits med transiente transfektionsreagenser og elektroporation med henblik på at dæmpe det immunmodulerende middelhavsfebergen (MEFV) i bovine monocyte-deriverede makrofager. Gruppen testede metoder til optag af small interfering RNA, nedbrydning af målgenet, celletoksicitet og induktion af type I-interferonrespons.

Elektroporation var omtrent lige så effektiv til at nedbryde MEFV som transfektionsreagenser. I modsætning til reagenserne inducerede elektroporation ikke noget interferonrespons, men celleviabiliteten var lavere. Spørgsmål om levedygtighed og transfektionseffektivitet for elektroporation tages generelt som en vurdering af teknikken på overfladen.

Dr. Jensen konkluderede, at “brugen af transfektionsreagenser er mere egnet end elektroporation til vores arbejde med at undersøge værtsmakrofaggeners rolle i svaret på infektion”, men at “valget mellem at transficere eller elektroporere small interfering RNA i celler afhænger af de enkelte eksperimenter.”

I mindst nogle tilfælde, hvor elektroporationsresultaterne er suboptimale, har forskerne forsømt at optimere andre betingelser end den elektriske pulsstyrke. Som Hu og kolleger for nylig bemærkede,4 er elektroporationens effektivitet påvirket af ikke-elektriske faktorer såsom celle- eller vævstype og DNA-formulering.

Elektroporation er blevet en uundværlig metode til både in vitro og in vivo-udviklingsbiologi. En stor del af dette arbejde foregår i enkeltceller, hvilket bidrager til en model af stor interesse inden for terapeutik, diagnostik, lægemiddeloverførsel og cellebiologi. Direkte nanoporering af enkeltceller er vanskelig på grund af den usikkerhed, der er forbundet med levedygtigheden efter porering.

Forskere på Northwestern University har udviklet en enkeltcelleteknik, der giver høj levedygtighed og effektivitet.5 Deres fremgangsmåde anvender en mikrofabrikeret cantilever-enhed, nanofountain-sonden (NFP). Den leverer molekyler til cellerne mere skånsomt end bulk-mikroinjektion eller nanoporation. Forskerne har demonstreret NFP-medieret elektroporation af enkelte HeLa-celler med en transfektionseffektivitet på bedre end 95 %, en levedygtighed på 92 % og kvalitativ doseringskontrol.

NFP’er repræsenterer en forbedring i forhold til ældre transfektionsteknologier, der anvender sonder med atomkraftmikroskop. Teknikker baseret på atomkraftmikroskopi medfører ofte, at cellerne mister fasthæftning eller brister. NFP forårsager mindre skade på cellerne.