Elektroakupunktur dæmper oxidativt stress i lever og nyre hos bedøvede rotter

13 -ORIGINAL ARTIKEL
METABOLISME

Elektroakupunktur dæmper oxidativ stress i lever og nyre hos bedøvede rotter1

Eletroakupuntura atenua o estresse oxidativo no fígado e no rim em ratos anestesiados

Agamenon Honório SilvaI; Lanese Medeiros FigueiredoI; Paulo Araujo DiasI; Alberico Ximenes do Prado NetoII; Paulo Roberto Leitão de VasconcelosIII; Sérgio Botelho GuimarãesIV

IFellow Master Degree, Department of Surgery, Postgraduate Program, UFC, Ceara, Brasilien. Tekniske procedurer, indsamling og fortolkning af data. Artiklen er en del af en kandidatafhandling (AHS)
IIGraduate student, UFC, Ceara, Brasilien. Har hjulpet med tekniske procedurer, indsamling af data
IIIPhD, lektor, koordinator, postgraduate program, afdeling for kirurgi, UFC, Ceara, Brasilien. Kritisk revision og fortolkning af data
IVPhD, lektor, afdeling for kirurgi, leder, LABCEX, UFC, Ceara, Brasilien. Tutor, udformning, design, intellektuelt og videnskabeligt indhold af undersøgelsen, manuskriptskrivning, statistisk analyse

Korrespondance

ABSTRACT

ÅR FORMÅL: Undersøge virkningerne af en enkelt elektroakupunktursession (EA) ved akupunkturpunkterne Zusanli (ST-36) og Zhongwan (CV-12) kombineret i regulering af oxidativt stress i lever og nyre hos bedøvede rotter.
METODER: 18 raske rotter tilfældigt fordelt på 3 grupper (n=6) blev bedøvet intraperitonealt med ketamin (90mg kg-1 kropsvægt) + xylazin (10mg/kg kropsvægt): G-1: kontrol (bedøvelse), G-2: bedøvelse+EA10Hz og 10 mA, 10 Hz) anvendt på højre ST-36 og CV-12 akupunkturpunkter i 30 minutter. G-3 blev ligeledes behandlet, men med en ti gange højere frekvens (100 Hz). G6PDH-aktivitet, malondialdehyd- (MDA) og glutathion- (GSH) niveauer blev analyseret spektrofotometrisk.
RESULTATER: Leverens MDA- og GSH-koncentrationer steg signifikant hos rotter, der blev udsat for EA 10 Hz (p<0,01) og EA 100 Hz (p<0,001), sammenlignet med kontrol G-1. Lever- og nyre G6GPH-aktivitet faldt signifikant i G-2 (p<0,01) og G-3 (p<0,001) sammenlignet med G-1 i EA100Hz-rotter. Et lignende mønster blev fundet i nyre G6PDH-aktiviteten hos EA10Hz-rotter.
KONKLUSION: En enkelt 30-minutters EA 10/100Hz-session forbedrer lipidperoxidation og reducerer samtidig oxidativ stress i lever- og nyrevæv i en rottemodel.

Nøgleord: Akupunktur. Elektroakupunktur. Lipidperoxidation. Oxidativ stress. Rats.

RESUMO

OBJETIVO: Investigar os efeitos de uma única sessão de eletroacupuntura (EA) aplicada nos acupontos Zusanli (E-36) e Zhongwan (RM-12) simultaneamente, na regulação do estresse oxidativo no fígado e rins em ratos anestesiados.
METODE: 18 raske rotter, tilfældigt fordelt i tre grupper (n = 6), blev bedøvet med ketamin (90 mg/kg kropsvægt) + xylazin (10 mg/kg kropsvægt): G-1: Kontrol (anæstesi), G-2: anæstesi + EA10Hz og G-3: anæstesi + EA100Hz. Rotterne i G-2-gruppen blev udsat for EA (pulserende firkantede bølger, 10 mA, 10 Hz) på højre ST-36- og VC-12-akupunkturpunkt i 30 minutter. I rotterne fra G-3-gruppen blev der anvendt en 10 gange højere frekvens (100 Hz). Aktiviteten af G6PDH-enzymet og koncentrationerne af malondialdehyd (MDA) og glutathion (GSH) blev kontrolleret ved spektrofotometri.
RESULTATER: Leverkoncentrationerne af MDA og GSH var signifikant forøget hos rotter, der blev udsat for AE ved brug af 10 Hz (p <0,01) og 100 Hz (p <0,001) sammenlignet med kontrol. G6GPH-aktiviteten var signifikant nedsat i G-2 (p <0,01) og G-3 (p <0,001) i lever og nyre sammenlignet med G-1-gruppen hos rotter, der blev behandlet med 100 Hz.
KONKLUSION: En enkelt 10/100 Hz EA-session i 30 minutter øger lipidperoxidationen og reducerer samtidig oxidativ stress i leveren og nyrerne hos raske rotter.

Deskriptorer: Akupunktur. Elektroakupunktur. Lipidperoxidation. Oxidativt stress. Rotter.

Indledning

Manuel akupunktur (MA) er en af de vigtigste behandlingsformer inden for traditionel kinesisk medicin. Det indebærer brug af skarpe, tynde nåle, der sættes ind i kroppen på meget specifikke punkter (akupunkturpunkter). MA har været anvendt i flere årtusinder i orientalske lande og accepteres i stigende grad af behandlere og patienter også i Vesten1. Elektroakupunktur (EA) er en modifikation af denne teknik, hvor små elektriske strømme anvendes på nåle, der tidligere er indført i kroppen, og synes at have mere konsekvente og reproducerbare resultater i mange specifikke kliniske og forskningsmæssige sammenhænge2-4. EA anvendt på Zusanli (ST-36) akupunkt reducerede lipidperoxidation i eksperimentelle modeller af iskæmi/reperfusion såsom rotte rygmarv5, hjerne6 og blodserum7 og svinehjerte muskel8.

Chakrabarti et al.9 undersøgte effekten af enkeltstående, akut (7 pulser/sek., 0,75 volt) og kronisk (4 pulser/sek., 0,75 volt) elektroakupunkturbehandling på skiftende dage i en periode på 21 dage på hepatiske funktioner hos rotter. Der blev anvendt to rygakupunkturpunkter sammen med ST-36. Efter kronisk behandling faldt leverens mikrosomale lipidperoxidationsværdi signifikant. Da manuel stimulering af akupunkturpunktet ST-36 desuden er i stand til at dæmpe nyreskader induceret af sepsis10 , er det muligt, at elektrisk stimulering af dette akupunkturpunkt kan ændre koncentrationerne af MDA, der er en indikator for cellemembranskader, i nyrevæv.

Fysiologiske processer reguleres af enzymer. NADPH er det vigtigste intracellulære reduktionsmiddel, og dets produktion er hovedsagelig afhængig af glukose-6-fosfatdehydrogenase. Hvis G6PDH-aktiviteten hæmmes, sker der samtidig et fald i NADPH-aktiviteten, et coenzym, der er afgørende for beskyttelsen mod oxidative skader. Både cellernes integritet og hele det antioxidante system er afhængige af en tilstrækkelig tilførsel af NADPH11. Mange artikler har påvist virkningerne af MA og EA på ST-36 akupunkturpunktet med hensyn til at dæmpe oxidativt stress i forskellige eksperimentelle sygdomme5-9. Desuden kan brugen af ketamin+xylazin, en anæstesiblanding, der ofte anvendes i eksperimentelle undersøgelser, inducere en vis grad af oxidativt stress hos et sundt dyr12-13.

Det er tidligere blevet vist, at der udskilles store mængder endogene opioide peptider fra binyrerne, når CV-12 akupunkturpunkter stimuleres ved hjælp af akupunktur med 2 Hz14. Da en højfrekvent EA (15 Hz) blev anvendt til stimulering af akupunkturpunktet CV-12, blev der opdaget flere kilder til endogene opioide peptider15. Vi havde derfor til formål at undersøge, om anvendelse af EA, der stimulerer både ST36- og CV-12-akupunkturpunkterne ved hjælp af to forskellige frekvenser, 10 Hz og 100 Hz, kan ændre MDA- og GSH-indholdet i lever og nyre, og om der er en forskel i lipidperoxidation og oxidativ stress mellem 10 Hz og 100 Hz EA hos raske gnavere.

Metoder

Dyreforberedelse

Hanlige Wistar-rotter på 280-400 g, leveret af det medicinske fakultets facilitet for opdræt af smådyr (Federal University of Ceara), blev holdt under kontrollerede miljøforhold (24 °C _relativ luftfugtighed 40-60 %, 12 timers vekslende lys/mørke-cyklus, mad og vand ad libitum). De tilsvarende menneskelige højre ST-36- og CV-12-akupunkturpunkter blev udvalgt til nålestik og elektrisk stimulering. Den anvendte akupunktnomenklatur følger WHO-nomenklaturen16. ST-36 akupunkturpunktet er placeret 5 mm under fibulahovedet under knæleddet og 2 mm lateralt i forhold til skinnebenets forreste tuberkel. Punktering af ST-36 akupunkt stimulerer den laterale surale cutaneus suralis, den kutane gren af nervus saphenus og dybere, den dybe peroneusnerve17-18. Akupunkturpunkt CV-12 er placeret i den forreste midterlinje af det øvre abdomen, 20 mm under sternal synchondrose. Dette område er innerveret af den forreste kutane gren af den 8. interkostalnerve18.

Materialer

Der blev anvendt engangs nåle af rustfrit stål (0,20×30 mm, 0,5 cm, DongBang Acupuncture Inc., Chung Nam, Korea). EL-608-elektrostimulatoren blev købt hos NKL Produtos Eletrônicos Ltda., Brusque, Santa Catarina, Brasilien.

Eksperimentelle grupper

Dyrene blev bedøvet intraperitonealt med en frisklavet blanding af ketamin (90 mg kg/kropsvægt) og xylazin (10 mg kg/kropsvægt). Rotter blev tilfældigt fordelt i 3 lige store grupper som følger:

* Gruppe 1 (bedøvelse) – 6 rotter

* Gruppe 2 (EA 10Hz) – 6 rotter

* Gruppe 3 (EA 100Hz) – 6 rotter

Gruppe 1 (kontrol) rotterne blev bedøvet som beskrevet. Seks minutter senere blev rotternes mave åbnet, og lever og højre nyre blev fjernet. Gruppe 2 (EA10Hz) rotter blev bedøvet som beskrevet. Efter rutinemæssig huddesinfektion med 75 % ethanol blev steriliserede engangsnåle af rustfrit stål (0,25 mm × 30 mm) indført vinkelret så dybt som 2-3 mm ved højre ST-36- og CV-12-akupunkturpunkt. Der blev tilsluttet elektroder til begge nåle og til en elektrostimulator (NKL EL-608); pulserende firkantede bølger, 10 Hz, 10 mA, blev anvendt i 30 minutter. Prøverne blev indsamlet 30 minutter senere. Gruppe 3 (EA100Hz) rotter blev underkastet EA som gruppe 2. Der blev dog anvendt en ti gange højere frekvens (100 Hz).

Biokemiske bestemmelser

Parametre, der blev bestemt, omfattede G6PDH-aktivitet, malondialdehyd (MDA) og glutathion (GSH)-koncentrationer. Vævsprøver blev snap-frosset i flydende nitrogen og opbevaret i glasrør ved -70º indtil den efterfølgende forberedelse og analyse af homogenater af lever og nyre. Lipidperoxidation blev analyseret ved at måle malondialdehyd som TBA-reaktive stoffer19. Kort fortalt blev H3PO4 (1 %, 3 mL) og vandig TBA-opløsning (0,6 %, 3 mL) tilsat 10 % homogenat (0,5 mL). Assaymediet blev rystet og opvarmet på et kogende vandbad i 45 minutter. Efter afkøling blev der tilsat 4 mL n-butanol, og blandingen blev rystet. Efter adskillelse af n-butanollaget ved centrifugering ved 1200 g i 15 min. blev dets optiske tæthed bestemt i et spektrofotometer (Beckman DU 640 B; Beckman Instruments, nu Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, USA) med henholdsvis 535 og 520 nm som absorptionsbølgelængder. Forskellen mellem resultaterne af de to optiske tæthedsbestemmelser blev taget som TBA-værdi, og mængden af malondialdehyd (MDA) i testiklerne blev beregnet, sammenlignet med MDA-standarder og udtrykt som mikromol MDA pr. gram vådt væv. GSH-niveauet blev vurderet efter Sedlak og Lindsays metode20 , som er baseret på reaktionen mellem thiolgrupper og 5-5-dithiobis-(2-nitrobenzoesyre), hvorved der dannes en forbindelse, der absorberer lys ved 412 nm. Mængden af GSH blev bestemt ud fra en standardkurve, der samtidig blev opnået under de samme betingelser med forskellige koncentrationer af GSH. G6PDH-aktiviteterne blev vurderet efter metoder, der er beskrevet tidligere21. Enzymaktiviteten blev aflæst spektrofotometrisk.

Dataanalyse

Graphpad Prism 5.0 (GraphPad Software, San Diego California USA, www.graphpad.com) blev anvendt til beregning og statistisk analyse. Alle resultater blev udtrykt som gennemsnit ± SD. Alle data blev testet for fordeling (Kolmorogov-Smirnov-test med Dallal-Wilkinson-Lilliefor P-værdi). Envejs ANOVA eller Kruskal-Wallis-test, alt efter behov, blev udført for at bestemme forskelle mellem grupper i MDA- og GSH-koncentrationer og G6PDH-aktivitet i lever- og nyrevæv. I post hoc-analysen (Tukey eller Dunn) blev en sandsynlighedsværdi på p<0,05 anset for at indikere statistisk signifikans.

Resultater

GSH-analyse

Lever GSH-koncentrationer steg signifikant hos rotter, der blev udsat for EA 10Hz og EA 100Hz (p<0,001), sammenlignet med kontrol (Figur 1). Lignende stigninger i nyrernes GSH-koncentrationer opstod i både EA10Hz- og EA100Hz-grupperne (Figur 2). Derudover steg lever- og nyre GSH-koncentrationerne signifikant hos EA100Hz-behandlede rotter sammenlignet med EA10Hz-gruppen.

MDA-analyse

Lever MDA-koncentrationer steg signifikant hos rotter, der blev udsat for EA10Hz (p<0,01) og EA100Hz (p<0,001), sammenlignet med kontrolgruppen (figur 3). Lignende stigninger i nyre-MDA-koncentrationer opstod i både EA10Hz- og EA100Hz-grupperne (Figur 4). Nyrernes MDA-koncentrationer steg signifikant i EA100Hz-gruppen sammenlignet med EA10Hz-gruppen.

G6PDH-assay

Liver G6GPH-aktivitet faldt signifikant i EA100Hz-grupperne (p<0,001) sammenlignet med kontrolgruppen (Figur 5). Et lignende mønster blev fundet i nyre G6PDH-aktivitet i EA10Hz-rotter. Nyre G6PDH-aktiviteten var ikke forskellig i begge grupper (Figur 6).

Diskussion

I vores forsøg blev den oxidative stress induceret ved brug af ketamin, et dissocierende bedøvelsesmiddel, der ofte anvendes enten under veterinære procedurer eller til eksperimentelle formål. Alva et al.12 viste, at ketamin fører til øgede plasmatiske nitrogenoxidniveauer, inducerer metabolisk acidose og forårsager oxidativ skade, dog uden at nå hepatisk toksicitet.

Antiperoxidative virkninger af lavfrekvent EA er blevet påvist. Siu et al.6 elektrostimulerede akupunkturpunkterne GB-20, der er placeret på den bageste side af halsen, under baghovedbenet, i depressionen mellem sternocleidomastoideus-musklen og trapezius-musklen og ST-36, ved hjælp af flere anvendelser før cerebral iskæmi og konkluderede, at 2 Hz EA delvis kunne regulere lipidperoxidationen ved cerebral iskæmi. GB-20 og ST-36 havde en lignende gavnlig virkning6. I vores undersøgelse inducerede brugen af EA en signifikant stigning i MDA-koncentrationen i leveren (figur 3) og nyrerne (figur 4) i EA10Hz- og EA100Hz-grupperne. Yderligere stigning i lipidperoxidation opstod i EA100Hz-gruppen sammenlignet med EA10Hz-rotter. Dette tyder på, at nyrerne er mere modtagelige for lipidperoxidation end leveren. Det ser ud til, at brugen af elektrisk stimulation ved hjælp af høje frekvenser i en enkelt session øger peroxidationen af lipider i denne rottemodel.

Yu et al.22 evaluerede den rolle, som nålestimulering af fire forskellige akupunkturpunkter spiller: GB-34 (Yanglingquan), LR-3 (Taichong), ST-36 (Zusanli) og SP-10 (Xuehai) akupunkturpunkter på regulering af oxidativ stress i det nigrostriatale system i den 6-hydroxydopamin-læsionerede rotte og konkluderede, at akupunkturstimulering forhindrede reduktionen af GSH-niveauet såvel som stigningen i MDA-niveauet.

Da vi undersøgte virkningerne af en enkelt elektroakupunktursession, mens vi i Yu et al.22 evaluerede virkningerne af den klassiske akupunkturbehandling, der blev udført to gange om dagen i 14 dage, mener vi, at brugen af elektrisk stimulering i en enkelt session kan være ansvarlig for stigningen i MDA-niveauet. På den anden side inducerede EA anvendt i en enkelt session en signifikant stigning i GSH-koncentrationen i både lever- (Figur 1) og nyrevæv (Figur 2). Den beskyttende virkning af EA er større ved højere frekvenser, som det fremgår af den øgede koncentration af GSH i nyrerne hos EA100Hz rotter sammenlignet med EA10Hz dyr.

G6PDH spiller en meget vigtig rolle i cellernes respons på oxidativ stress. Indtil for nylig var der en generel opfattelse, at dette enzyms betydning var begrænset til menneskelige erythrocytter, som mangler andre NADPH-producerende ruter23. Nylige observationer har vist, at G6PDH spiller en beskyttende rolle mod reaktive oxygenarter i eukaryote celler, der har alternative veje til produktion af NADPH24. I denne undersøgelse faldt G6PDH-aktiviteten signifikant i leveren hos EA10Hz- og EA100Hz-grupperne. Et lignende fald i aktiviteten blev set i nyrerne hos EA10Hz rotter. Nyrernes GSH-koncentrationer steg hos EA100Hz rotter på det tidspunkt, hvor der blev påvist et samtidigt fald i G6PDH i samme gruppe.

Yu et al.25 har påvist, at G6PDH-aktivering er omvendt korreleret med GSH intracellulære niveauer, idet de har anvendt cellesuspensionskulturer af Taxus chinensis. Det er muligt, at dyreceller kunne have en lignende adfærd.

Med hensyn til styrker og svagheder ved denne undersøgelse i forhold til andre, er der ingen offentliggjorte undersøgelser, der kan sammenlignes direkte med den foreliggende forskning. På trods af at peroxidative virkninger af EA blev påvist her, i modsætning til andre undersøgelser6, blev 10 Hz elektrostimulering ikke anvendt af andre forskere. I offentliggjorte undersøgelser blev der anvendt lavfrekvent EA (2 Hz) i flere sessioner. I vores undersøgelse blev der anvendt en enkelt session. På den anden side tyder faldet i G6PDH-aktiviteten i leveren og nyrerne hos rotter behandlet med henholdsvis 100 Hz og 10 Hz sammen med en samtidig stigning i GSH-niveauerne efter en enkelt EA-session på, at højere frekvenser kunne inducere en bedre beskyttelse mod oxidativt stress. De involverede mekanismer er indtil videre ikke klarlagt. Yderligere undersøgelser kan kaste nyt lys over de beskyttende virkninger af elektroakupunktur.

Slutning

De indsamlede data støtter hypotesen om, at en enkelt 30-minutters EA 10/100 Hz-session øger lipidperoxidation og samtidig reducerer oxidativ stress ved at øge GSH-niveauerne i lever- og nyrevæv i en rottemodel.

1. Campbell A. Oprindelsen af akupunktur. Acupunct Med. 2002;20(2-3):141

6. Siu FK, Lo SC, Lo SC, Leung MC. Effektivitet af multipel præ-iskæmi elektroakupunktur med hensyn til at dæmpe lipidperoxidation induceret af cerebral iskæmi hos voksne rotter. Life Sci. 2004;75(11):1323-32.

8. Wang XR, Xiao J, Sun DJ. Myokardiale beskyttende virkninger af elektroakupunktur og hypotermi på svinehjerte efter iskæmi/reperfusion. Acupunct Electrother Res. 2003;28(3-4):193-200.

12. Alva N, Palomeque J, Carbonell T. Nitric oxide induceret af ketamin/xylazin-anæstesi opretholder hepatisk blodgennemstrømning under hypotermi. Nitric Oxide. 2006;15(1):64-9.

14. Lin JG, Chang SL, Cheng JT. Frigivelse af beta-endorfin fra binyrerne til at sænke plasmaglukose ved elektroakupunktur ved Zhongwan-akupunkturpunktet hos rotter. Neurosci Lett. 2002;326(1):17-20.

15. Lin JG, Chen WC, Hsieh CL, Tsai CC, Cheng YW, Cheng JT, Chang SL. Flere kilder til endogent opioidpeptid, der er involveret i det hypoglykæmiske respons på 15 Hz elektroakupunktur ved Zhongwan-akupunkturpunktet hos rotter. Neurosci Lett. 2004;366(1):39-42.

16. Verdenssundhedsorganisationen (WHO). Standardakupunkturnomenklatur: en kort forklaring af 361 klassiske akupunkturpunkter og deres flersprogede sammenlignende liste. 2ed. WHO’s regionalkontor for det vestlige Stillehav; 1993.

23. Xu Y, Osborne BW, Stanton RC. Diabetes forårsager hæmning af glucose-6-fosfatdehydrogenase via aktivering af PKA, hvilket bidrager til oxidativt stress i rotte-nyrebark. Am J Physiol Renal Physiol. 2005;289(5):F1040-7.

24. Salvemini F, Franzé A, Iervolino A, Filosa S, Salzano S, Ursini MV. Forbedrede glutathionniveauer og oxidresistens medieret af øget ekspression af glucose-6-fosfatdehydrogenase. J Biol Chem. 1999;274(5):2750-7.

25. Yu LJ, Lan, WZ, Chen C, Yang Y. Glutathionniveauer kontrollerer glucose-6-fosfatdehydrogenaseaktivitet under elicitor-induceret oxidativ stress i cellesuspensionskulturer af Taxus chinensis. Plant Sci. 2004;167:329-35.