Echovirus 4 i forbindelse med hånd-, fod- og mundsyge

VIROLOGI

Echovirus 4 i forbindelse med hånd-, fod- og mundsyge

Echovirus 4 associerado à doença de mão, pé e boca

Denise Hage Russo; Adriana Luchs; Bráulio Caetano Machado; Rita de Cássia Carmona; Maria do Carmo Sampaio Timenetsky

Laboratorium for enterovirusser, Adolfo Lutz Institute, São Paulo, SP, Brasilien

Svar til

SAMMENFATNING

Hånd-, mund- og klovsyge (HFMD) er en smitsom enteroviral infektion, der primært forekommer hos børn og er karakteriseret ved vesikulære palmoplantareruptioner og erosiv stomatitis. Echovirus 4 (EV-4) har ofte været forbundet med aseptisk meningitis. Der er ikke tidligere blevet rapporteret om en sammenhæng mellem HFMD og EV-4. To prøver fra et barn på 14 måneder, der havde let feber, sår i munden, udslæt med blærer på håndflader og fodsåler, blev sendt til Adolfo Lutz-instituttets laboratorium for enteriske virus. De kliniske prøver blev inokuleret i tre forskellige cellelinjer, og de prøver, der viste cytopatisk effekt (CPE), blev underkastet indirekte immunofluorescensanalyse (IFA) og RT-PCR i et trin. Agarosegelelektroforese af RT-PCR-produktet viste et produkt med 437 bp, som er karakteristisk for enterovirusgruppen. Echovirus 4 blev identificeret ved hjælp af IFA. Selv om HFMD er en virusinfektion, der hovedsagelig er forbundet med Enterovirus 71 (HEV-71) og Coxsackievirus A16 (CV-A16), viser vores resultater en mangfoldighed af serotyper i forbindelse med HFMD og understreger vigtigheden af epidemiologisk overvågning af denne sygdom og dens komplikationer.

Nøgleord:

RESUMO

A Doença de Mão, Pé e Boca (DMPB) é uma infecção enteroviral contagiosa que ocorre principalmente em crianças sendo caracterizada por erupções palmoplantares vesiculares e estomatite. Echovirus 4 (EV-4) é comumente associado a meningite asséptica. Associeringen af DMPB med EV-4 er ikke tidligere blevet beskrevet. To prøver fra et 14 måneder gammelt barn med feber, halssekretion og udslæt på håndflader og fødder blev sendt til laboratoriet for enteriske virus på Instituto Adolfo Lutz. Prøverne blev inokuleret i tre forskellige cellelinjer; de prøver, der viste cytopatisk effekt (CPE), blev underkastet indirekte immunofluorescensanalyse (IFI) og “one step” RT-PCR. Agarosegelelektroforese udført med PCR-produktet viste et produkt på 437pb, som er karakteristisk for Enterovirus-gruppen. Serotype EV-4 blev identificeret ved IFI. Selv om DMPB er en virusinfektion, der hovedsagelig er forbundet med Enterovirus 71 (HEV-71) og Coxsackievirus A16 (CV-A16), understreger vores resultater behovet for epidemiologiske og laboratorieundersøgelser, der er rettet mod EV-4 som årsag til DMPB.

INDLEDNING

Hånd-, mund- og klovsyge (HFMD) er en almindelig sygdom hos spædbørn og børn under 10 år og er karakteriseret ved feber, sår i munden og udslæt med blærer. HFMD begynder med let feber, dårlig appetit, utilpashed og ofte ondt i halsen. En eller to dage efter ses feber og udvikling af sår i munden. Der forekommer almindeligvis små røde pletter med blister, der bliver til sår. De er normalt placeret på tungen, tandkødet og på indersiden af kinderne. Hududslættet udvikler sig over 1-2 dage med flade eller hævede røde pletter, og nogle med blærer. Udslættet klør ikke og er normalt placeret på håndfladerne og fodsålerne. Det forekommer også på balderne. Selv om nogle personer med HFMD kun kan have udslæt eller sår i munden4.

Smitte sker fra person til person ved direkte kontakt med udflåd fra næse og hals eller via fækal oral vej. HFMD overføres ikke til eller fra kæledyr eller andre dyr. Enkelte tilfælde af HFMD forekommer i hele verden, hyppigst om sommeren og det tidlige efterår4. Vertikal spredning fra mor til foster forekommer også, men i de tilfælde, hvor der ikke er nogen langtidskomplikationer, kan infektion i første trimester føre til spontan abort eller intrauterin væksthæmning. Der er rapporteret om andre komplikationer, herunder myokarditis, meningoencephalitis, lungeødem og endog død16.

Den første HFMD-rapport blev udarbejdet af ROBINSON & RHODES i 195812. De rapporterede om et exanthem med tilhørende feber og orale læsioner, der blev konstateret hos over 60 personer i juni og juli 1957 i Toronto, Canada. Coxsackievirus A16 (CV-A16) blev isoleret fra to tredjedele af 27 undersøgte afføringsprøver. Den næste rapporterede epidemi af Coxsackievirus fandt sted i Birmingham, England, i sommeren 1960 og blev beskrevet af ALSOP et al.2 , som konstaterede vesikulære læsioner på hænder og fødder med oropharyngeale læsioner, og som gav udbruddet navnet hand, foot and mouth disease16.

HFMD er forårsaget af enterovirus, der tilhører Picornavirus-familien (enkeltstrenget RNA, ikke omsluttet), og er oftest forbundet med CV-A16 eller Enterovirus 71 (HEV-71). Der er også rapporteret om sporadiske tilfælde, der er forbundet med CV-A4 til CV-A7, CV-A9, CV-A10, CV-B1 til CV-B3 og CV-B5. Infektionerne er normalt sporadiske, men der forekommer regelmæssigt epidemier. Den første virusinfektion sker i mund- og ilealslimhinden og efterfølges af spredning til regionale lymfeknuder inden for 24 timer. Viremi følger hurtigt, og virus spredes til mundslimhinden og huden. Omkring den 7. dag efter infektionen kan antistofniveauet i serum begynde at stige 6,8.

PATIENTER OG METODER

Prover: I juli 2003 opstod der et HFMD-udbrud i en daginstitution i São Paulo City, og to afføringsprøver fra et 14 måneder gammelt mandligt barn, der var mistænkt for at være smittet, blev sendt til Adolfo Lutz-instituttets laboratorium for enteriske virus. Han havde feber, sår i munden, utilpashed, dårlig appetit og udslæt på håndflader og fodsåler. Andre otte børn i samme center i alderen fra 10 måneder til tre år havde lignende symptomer. HFMD blev diagnosticeret af andre medicinske centre (personlig kommunikation). Det var umuligt at indsamle parrede serumprøver for at fortsætte de serologiske tests til antistoftitrering.

Viral isolering og identifikation: Prøver indsamlet inden for seks dage efter skødet blev klaret under centrifugering ved 10.000 x g/60 minutter ved 4 ºC; antibiotika (streptomycin og penicillin ) blev tilsat, og supernatanten blev opbevaret ved -70 ºC indtil inokulering (0,1 og 0,2 mL/rør) på tre forskellige cellelinjer: RD (humant rhabdomyosarkom), HEp 2 (humant epidermisk larynxkarcinom) og Vero (grøn abenyre) indeholdende minimalt essentielt medium (henholdsvis Eagle’s L15, Eagle’s + AANE + piruvate og 199-medium). Derefter blev rørene opbevaret ved 35-37 ºC. Kulturerne blev observeret i inverteret mikroskop hver dag for at visualisere den cytopatiske effekt (CPE). Der blev foretaget successive passager af det inokulerede materiale, indtil der optrådte eller ikke optrådte en karakteristisk CPE for HEV-infektion7.

Indirekte immunofluorescensanalyse – IFA: Når cellekulturen udviste mindst 75 % CPE, blev den skrabet af røret, og cellesuspensionen blev plettet på et objektglas, som blev lufttørret og fikseret med acetone. Derefter blev den underkastet indirekte immunofluorescensanalyse (IFA) ved hjælp af specifikke monoklonale antistoffer, der er kommercielt tilgængelige (Chemicon International Inc., Temecula, CA/USA), til genus, gruppe og HEV-serotyper. Prøveglassets brønde blev undersøgt under et epifluorescensmikroskop3.

RT-PCR: Det virale RNA blev ekstraheret fra isolatvirus ved hjælp af Trizol® LS (Invitrogen, kat. 1296-010) og chloroform i overensstemmelse med producentens anvisninger. Efter centrifugering ved 12 000 xg blev den vandige fase separeret, og udfældningen blev foretaget med isopropylalkohol. RNA-pellet blev vasket med 75 % ethanol. Ved afslutningen af proceduren blev RNA’et tørret kortvarigt og resuspenderet med Milli-Q-vand; RNAsin blev tilsat, og RNA’et blev opbevaret ved -70 ºC. cDNA’et blev syntetiseret ved hjælp af det ekstraherede RNA og blandingen: 50 mM MgCl2; 10x PCR-buffer; 1,25 nM dNTP; 20 µM/µL primer AS1/S1; 2 µL Super Script II RNAse Reverse Transcriptase; 2,5 U/µL TaqQ DNA-polymerase; 40 U/µL RNAsin og Milli-Q-vand. Amplifikationsreaktionerne blev udført i Gene Amp PCR System 9600 Perkin Elmer termocycler med følgende programmering: (42 ºC/1 time) + (95 ºC/5 minutter) + 25 cyklusser (94 ºC/1 minut + 50 ºC/2 minutter + 72 ºC/1 minut) + (72 ºC/7 minutter). PCR-produkterne blev separeret ved hjælp af 1,5 % agarosegel, farvet med ethidiumbromid og visualiseret under UV-lys. Primerne rettet mod den 5′-ikke-translaterede region forstærkede et produkt på 437bp13.

RESULTATER

CPE, der tyder på HEV: afrunding, skrumpning, kernepyknose, refraktilitet og celledegeneration var følsomme over for RD- og Vero-celler. Tiden til rapportering af positive kulturer var ca. 4-7 dage.

En lys æblegrøn fluorescens i cellernes kerne og/eller cytoplasma kunne iagttages under epifluorescensmikroskopet ved 400x, hvilket indikerer en positiv reaktion på echovirus 4-serotype. IFA var negativ over for de andre monoklonale antistoffer.

RT-PCR blev anvendt til at bekræfte HEV-slægten. Agarosegelelektroforese viste et produkt med 437 bp, der identificerede HEV (fig. 1).

DISCUSSION

Det ætiologiske agens, der blev identificeret i denne undersøgelse, er HEV, der adskiller sig fra de andre, der tidligere har været forbundet med HFMD. Dette syndrom er almindeligvis blevet forbundet med CV-A16 og HEV-71, mens der ikke er fundet nogen epidemiologiske data om EV-4 i forbindelse med HFMD i litteraturen.

Det HFMD-udbrud, der fandt sted i Malaysia (1997), var imidlertid forbundet med EV-1, CV-A9 og HEV-711. HFMD forårsaget af HEV-71 er blevet forbundet med dødelige tilfælde af hjernebetændelse under udbruddene i Malaysia (1997) og Taiwan (1998)17. EV-7 blev i den sidste del af 2000 fundet som et ætiologisk agens for HFMD sammen med CV-A16 og EV-75. I Brasilien beskrev MOREIRA et al. (1995) en epidemisk exanthematisk sygdom, der var forbundet med coxsackievirus B3 (CV-B3)10. Der er ikke rapporteret om forbindelsen med EV-4 og HFMD i Brasilien, måske på grund af manglende klinisk mistanke.

EV-4 er generelt forbundet med aseptisk meningitis, encephalitis, lammelse, Güillan-Barré-syndromet, exanthem og luftvejssygdomme og er blevet fundet rundt om i verden, hovedsagelig som årsag til udbrud af aseptisk meningitis: i Cuba fra 1972 til 1999, i Cape Town, Sydafrika fra 1981 til 1989, i april 1997 i regioner i Israel og den palæstinensiske selvstyremyndighed, i Spanien i perioden 1988 til 2003, i efteråret 1982 i Polen og i Vellore og omegn i Indien i 20028,9,11,14,15,18.

Typisk er enterovirusinfektioner enten asymptomatiske eller resulterer i mild sygdom. Det anbefales derfor at indsamle serumprøver for at foretage antistoftitrering ved hjælp af mikroneutraliseringsteknik, hvilket vil være endnu et parameter til at bekræfte, at det isolerede virus er det ansvarlige for sygdommen. I forbindelse med isolering af afføringen bekræfter en firedobbelt stigning i serumtitreringen (serokonversion) den akutte infektion. Desværre var det ikke muligt at få serumprøver i denne undersøgelse.

På trods af blev alle de andre otte børn diagnosticeret som HFMD af medicinske centre, baseret på de kliniske tegn.

Og selv om dette resultat ikke kunne være nok til at fastslå, at EV-4 var årsag til sygdommen, syntes det rimeligt at konkludere, at signaler og tydelige kliniske manifestationer bekræfter hypotesen om, at virus ikke er en forbigående virus.

Det er vigtigt at fremhæve, at CV-A16 og HEV-71, der er kendt som hovedårsagen til HFMD, normalt producerer CPE i RD-, HEp2- og Vero-cellekulturer; men i denne undersøgelse blev de ikke identificeret.

Vores arbejde viser, at EV-4 er årsag til HFMD, og antyder muligheden for, at andre HEV-serotyper eventuelt kan være relateret til HFMD-tilfælde. Denne case report understreger nødvendigheden af at intensivere epidemiologiske og laboratorieundersøgelser af denne serotype, og overvågningen af andre HEV-serotyper, der er involveret i HFMD, skal øges i Brasilien.

NAKUNSKABER

Vi er specielt taknemmelige over for Dr. Luís Florêncio Salles Gomes for hans forslag og kritik af denne artikel.

1. ABUBAKAR, S.; CHEE, H.Y.; SHAFEE, N.; CHUA, K.B. & LAM, S.K. – Molekylær påvisning af enterovirus fra et udbrud af hånd-, mund- og klovsyge i Malaysia i 1997. Scand. J. infect. Dis., 31: 331-335, 1999.

2. ALSOP, J.; FLEWETT, T.H. & FOSTER, J.R. – “Hand-foot-and-mouth disease” (mund- og klovsyge) i Birmingham i 1959. Brit. med. J., 5214: 1708-1711, 1960.

3. BASTIS, D.; SIMONET, S.; PATTERSON, M.A. & NEILL, S. – Identifikation af enterovirus ved indirekte immunofluorescens ved hjælp af monoklonale antistoffer. Clin. diagnos. Virol. 3: 38-93, 1995.

4. CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION – Respiratory and Enteric Viruses Branch, 2004. (findes i http://www.cdc.gov/ncidod/dvrd/revb/Enterovirus/hfhf.htm). Tilgået i maj 2005.

5. CHUA, B.H.; McMINN, P.C.; LAM, S.K. & CHUA, K.B. – Sammenligning af de komplette nukleotidsekvenser af echovirus 7-stammen UMMC og prototypestammen (Wallace) viser en betydelig genetisk drift over tid. J. gen. Virol., 82: 2629-2639, 2001.

6. GRAHAM, B. – Hånd-, mund- og klovsyge. EMedicine Journal, 2002. (findes i http://www.emedicine.com/derm/topic175htm). Tilgået i maj 2005.

7. GRANDIEN, M.; FORSGREN, M. & EHRNST, A. – Enteroviruses and reoviruses. in: LENNETTE, E.H. & SCHMIDT, N.J., ed. Diagnostiske procedurer for virale og rickettsiale sygdomme. 6. udgave. Washington, American Public Health Association, 1989. s. 513-578.

8. HANDSHER, R.; SHULMAN, L.M.; ABRAMOVITZ, B. et al. – En ny variant af echovirus 4 i forbindelse med et stort udbrud af aseptisk meningitis. J. clin. Virol., 13: 29-36, 1999.

9. McINTYRE J.P. & KEEN, G.A. – Laboratorieovervågning af viral meningitis ved undersøgelse af cerebrospinalvæske i Cape Town 1981-9. Epidem. Infect., 111: 357-371,1993.

10. MOREIRA, R.C.; CASTRIGNANO, S.B.; CARMONA, R.C. et al. – En eksanthematisk sygdomsepidemi i forbindelse med coxsackievirus B3-infektion i en daginstitution. Rev. Inst. Med. trop. S. Paulo, 37: 235-238, 1995.

11. PIERZCHALA, K.; GRUDZINSKA, B.; BARA, M. & KLOSINSKA, E. – Senfølger af epidemisk viral meningitis. Wiad. lek., 42: 55-158, 1989.

12. ROBINSON, C.R.; DOANE, F.W. & RHODES, A.J. – Rapport om et udbrud af febril sygdom med pharyngeale læsioner og exanthem: Toronto, sommeren 1957; isolering af gruppe A Coxsackie-virus. Canad. med. Ass. J., 79: 615-621, 1958.

13. ROTBART, H.A. – Enzymatisk RNA-amplifikation af enterovirusene. J. clin. Microbiol. 28: 438-442,1990.

14. SARMIENTO, L.; MAS, P.; GOYENECHEA, A. et al. – Første epidemi af meningitis med echovirus 16 i Cuba. Emerg. infect. Dis., 7: 887-889, 2001.

15. SATHISH, N.; SCOTT, J.X.; SHAJI, R.V. et al. – Et udbrud af echovirusmeningitis hos børn. Indian Pediat. 41: 384-388, 2004.

16. SCOTT, L.A. & STONE, M.S. – Virale eksanthemer. Derm. Online J., 9: 4, 2003.

17. SHIMIZU, H.; UTAMA, A.; YOSHII, K. et al. – Enterovirus 71 fra dødelige og ikke-dødelige tilfælde af hånd-, mund- og klovsygeepidemier i Malaysia, Japan og Taiwan i 1997-1998. Jap. J. infect. Dis., 52: 12-15, 1999.

18. TRALLERO, G. & AVELLÓN, A. – Importancia del diagnostico de los Echovirus desde el punto de vista epidemiológico. Circulación de Echovirus 11 en los últimos años en España – Control Calidad SEIMC, 2004. (tilgængelig i http://seimc.org/control/revi_viro/echo11.htm). Tilgængelig i maj 2005

.