Dephosphorylering

V.B Proteinfosfataser i RPTK-signalering

Tyrosindephosphorylering er en anden hurtigtvirkende mekanisme til hæmning eller afslutning af signalering fra RPTK’er. Proteinfosforylering i signaltransduktion er reversibel, og PTK’er fungerer sammen med PTPaser ved at bestemme initiering, omfang og afslutning af tyrosinfosforylering. Nedregulering af RPTK-signalering sker ikke kun gennem direkte fosfotyrosin-defosforylering af selve RPTK’en (dvs. at RPTK’en er et substrat for PTPasen), men også gennem defosforylering af et afgørende downstream-mål for RPTK’en. Da tyrosin-fosforylerede proteiner, serin- og threonin-fosforylerede proteiner og endog fosfolipider er formidlere af RPTK-signalering, findes der eksempler på proteinserin/threonin-specifikke fosfataser og fosfoinositid-specifikke lipidfosfataser, der også formidler nedregulering af RPTK-initieret signalering. Nedenfor følger nogle eksempler samt en kort, generel beskrivelse af proteinphosphataser.

Alle identificerede PTPaser indeholder et konserveret, ∼280 aminosyre langt PTPase-domæne. Deres specifikke katalytiske aktivitet er ca. 1000 gange højere og meget mindre specifik end PTK’ernes. Som det er tilfældet for PTK’er, kan PTPaser opdeles i transmembran- og cytoplasmatiske PTPaser. Transmembran-PTPaser indeholder ekstracellulære regioner med motiver som fibronectin type III-lignende gentagelser, cadherin-lignende gentagelser og immunoglobulin-lignende domæner. De har en enkelt transmembran-spændende region, som normalt efterfølges af to PTPase-domæner, hvoraf kun den ene synes at bidrage med katalytisk aktivitet. Som det fremgår af deres ekstracellulære område, er visse transmembran-PTPaser, såsom PTPκ og PTPμ, involveret i homofil celle-celleadhæsion, og PTPμ kan stabilisere celle-cellekontakter ved at defosforylerer cateniner og cadheriner. Disse og andre transmembran-PTPPaser er ikke blevet impliceret i den direkte defosforylering af RPTK’er, i modsætning til de cytoplasmatiske PTPaser, hvoraf flere er i stand til direkte at defosforylerer RPTK’er.

Den hæmatopoietisk udtrykte, cytoplasmatiske proteintyrosinphosphatase SHP-1 er en af kun to SH2-domæne-holdige PTPaser, der er identificeret. SHP-1 binder sig til aktiverede RPTK’er, som CSF-1 og Kit/SCF-receptor, gennem et af sine to SH2-domæner. SHP-1’s og det strukturelt beslægtede SHP-2’s SH2-binding (se senere) ophæver en autoinhiberende begrænsning på PTPase-domænet. Det er således blevet påvist, at både CSF-1- og Kit/SCF-receptorerne er direkte substrater for SHP-1, og at SHP-1 er vigtig for den normale nedregulering af Kit- og CSF-1-receptorsignalering. Dette har også fysiologisk relevans. Derfor har mus med motheaten (me)-fænotypen, som skyldes naturligt forekommende tab af funktion (LOF)-mutationer i SHP-1, talrige hæmatopoietiske abnormiteter som følge af hyperproliferation af myeloid/monocytære og mastceller. Den deregulerede CSF-1- og Kit-receptorsignalering menes at forårsage disse defekter, hvilket understøttes af undersøgelser, der viser, at fænotypen hos dominerende white-spotting (W)-mutante mus, som har naturligt forekommende LOF-mutationer i Kit, lindres ved krydsning med me-mutante mus og omvendt. Disse og nyere data, der viser alternative transkriptioner, der enten forårsager truncationer af SHP-1 eller frameshift-mutationer, der resulterer i tab af SHP-1 i primære Kit-udtrykkende tumorcellelinjer etableret fra leukæmiske patienter, tyder på, at SHP-1 er en tumorsuppressor.

Proteintyrosinphosphatasen PTP1B er en anden cytosolisk phosphatase, som er involveret i den direkte nedregulering af RPTK-signalering. PTP1B binder sig til de aktiverede insulin- og IGF-1-receptorer gennem sit N-terminale katalytiske domæne gennem en ukendt mekanisme. Ved bindingen defosforylerer PTP1B direkte selve insulinreceptoren og dens vigtigste associerede docking-protein, insulinreceptorsubstrat-1 (IRS-1). Derfor medfører målrettet sletning af PTP1B hos mus hyperfosforylering af insulinreceptor og IRS-1 og sensibilisering af insulinsignalering. PTP1B defosforylerer også STAT5a og STAT5b og forhindrer derved deres nukleare translokation og transkriptionelle aktivitet. STAT5a og STAT5b fosforyleres af JAK’er, der aktiveres af cytokinreceptorer, men fosforyleres også direkte af flere RPTK’er.

PTP1B samt den receptorlignende PTPα og SHP-2, en anden SH2-domæne-holdig fosfatase, er imidlertid også blevet impliceret i styrkelsen af signalering nedstrøms RPTK’er. PTP1B overudtrykkes i brystkræftcellelinjer, hvor den forårsager dephosphorylering af Tyr527 ved C-terminus af c-Src. Dette fører til øget Src-kinaseaktivitet, da fosforylering af dette sted er hæmmende for Src-aktivitet gennem en allosterisk, autoinhibitorisk mekanisme. Transmembran RPTPα er tyrosinfosforyleret in vivo ved Tyr789, hvilket skaber et bindingssted for c-Src, hvilket gør RPTPα i stand til at defosforylerer Tyr527 i Src in vitro. Interessant nok er både binding og affosforylering af Src afhængig af fosforylering ved Tyr789, og der er blevet foreslået en fosfotyrosinforskydningsmekanisme for aktivering af Src af RPTPα. I overensstemmelse hermed ophæver kinase-defekte eller Tyr789Phe-mutanter af RPTPα neoplastisk transformation ved overudtrykt RPTPα, og målrettet afbrydelse af RPTPα medfører en nedsat aktivitet af Src-familiemedlemmer i celler fra mutantmusene, hvilket korrelerer med øgede fosforyleringsniveauer af Tyr527. SHP-2, som er ubiquitært udtrykt, associerer in vivo via sine SH2-domæner med talrige RPTK’er og PTK-substrater, herunder receptorerne for PDGF, EGF, insulinlignende vækstfaktor-1 (IGF-1) og SCF samt dockingproteinet IRS-1. SHP-2 bliver tyrosinfosforyleret som reaktion på stimulering med flere vækstfaktorer, og tyrosinfosforyleret SHP-2 binder sig til receptorerne for enten PDGF eller SCF samt adaptormolekylet Grb2. Det er blevet påvist, at det bundne SHP-2 til gengæld selektivt defosforylerer tyrosinrester i PDGFR-β, der er vigtige for bindingen af PI 3′-kinase og GAP for Ras. Desuden hæmmer mikroinjektion af blokerende antistoffer mod SHP-2 eller ekspression af SHP-2 SH2-domæner eller af katalytisk inaktivt SHP-2 mitogenese, der stimuleres af EGF, insulin og IGF-1. Disse resultater tyder på, at SHP-2 er en opstrømsaktivator af Ras-signalering og andre Grb2-regulerede signalveje og muligvis er en modulator af RPTK-induceret PI 3′-kinase-signalering. I lighed med SHP-1 kan binding af SHP-2 muligvis aktivere dens katalytiske funktion. SHP-2 hævdes også at defosforylerer Tyr527 i C terminus af Src, hvilket giver yderligere positiv regulering af signalering.

Flere proteinserin/threoninkinaser og substrater heraf defosforyleres af den store serin/threonin-specifikke fosfatase PP2A. Dette er en cytoplasmatisk og nukleær heterotrimer fosfatase, der består af en strukturel A-underenhed, en regulatorisk B-underenhed og en katalytisk C-underenhed. PP2A er bundet til adskillige stillads-proteiner gennem sin regulatoriske underenhed, og dens aktivitet er nøje reguleret i forbindelse med sammensatte stilladser. Et af de vigtige substrater i RPTK-signalering er PI 3′-kinase-målet Akt, en proteinserin/threoninkinase, der formidler celleoverlevelse til dels gennem fosforylering af Bcl-2-familiemedlemmet Bad. PP2A defosforylerer det aktiverende fosforyleringssted T308 i Akt, som er afgørende for kinaseaktiviteten. Desuden kan PP2A affosforylerer det antiapoptotiske molekyle Bcl-2, hvilket ophæver dets overlevelsesfunktion. Der er blevet identificeret adskillige andre substrater for PP2A, hvoraf mange er vigtige downstream-mål for RPTK’er.

To fosforinositidspecifikke fosfataser, henholdsvis PTEN og SHIP1/2, defosforylerer specifikt D-3- og D-5-positionen af inositolringen i PtdIns(3,4,5)P3, en af de vigtigste effektorer af PI 3′-kinase-signalering. Dette modvirker RPTK-initieret PI 3′-kinase-signalering, og PTEN har derfor vist sig at være et hyppigt muteret humant tumorsuppressor-gen. Inaktiverende mutationer i PTEN er medvirkende til visse neuronale, bryst- og kimcelletumorer hos mennesker, hvilket er forbundet med øget aktivitet af Akt.