Camptothecin

3.1 Introduktion

Camptothecin (CPT) er et monoterpenindolalkaloid, der først blev isoleret fra Camptotheca acuminata af Monroe Wall og Mansukh Wani i USDA’s Plant Introduction Division i midten af 1958 (Wall et al., 1966). C. acuminata er et træ, der er hjemmehørende i Kina, og dets bark er blevet brugt i traditionel kinesisk medicin siden tidernes morgen. Wall og Wani (1996), der er medopdagere af CPT og Taxol, har gennemgået begivenhederne i forbindelse med opdagelsen af CPT. Senere i 1950’erne og i slutningen af 1960’erne fik CPT’s potente kræftbekæmpende aktiviteter forskere til at undersøge den kemiske totalsyntese og validere dens potentiale ved hjælp af prækliniske og kliniske undersøgelser (Schultz, 1973). CPT’s effektivitet blev undersøgt i USA ved at gennemføre kliniske fase I- (Gottlieb og Luce, 1972; Muggia et al., 1972) og fase II-forsøg (Moertel et al., 1972). Klinisk anvendelse af CPT var tydelig i Kina til behandling af mave- og blærekræft og visse typer leukæmi, ofte i kombination med kortikosteroider (Pettit, 1976). De tidlige undersøgelser viste, at den vandopløselige carboxylatform af CPT (CPT-natriumsalt) viste nogle positive resultater mod hals- eller blærekræft i Kina (Xu, 1980). Resultaterne af kliniske forsøg fra USA med anvendelse af CPT’s carboxylatform viste sig imidlertid ikke at være så lovende som kræftmedicin. Denne uoverensstemmelse kan skyldes, at de amerikanske kliniske forsøg kun omfattede patienter, som allerede havde vist resistens over for anden behandling. Ikke desto mindre fik manglen på konsistent effektivitet af CPT-karboxylatformen i kliniske forsøg forskerne til at fokusere på CPT-laktonformen med henblik på yderligere forbedrede lægemidler. Kliniske forsøg med CPT blev imidlertid i det væsentlige afbrudt i 1970’erne på grund af den manglende evne til at løse CPT’s vanduopløselige egenskab i laktonformen, lave responsrater og høj toksicitet såsom myelosuppression, gastrointestinale toksiciteter og hæmoragisk blærebetændelse (Horwitz, 1975; Rozencweig et al., 1976)

Og selv om de kliniske forsøg med CPT blev afsluttet i 1970’erne, fortsatte undersøgelserne med hensyn til dets virkningsmekanisme i de senere år. Det ægteparret Dr. Marshall og Susan Horwitz fra Albert Einstein College of Medicine samt andre gjorde de tidlige resultater i forbindelse med CPT’s virkningsmekanisme. Deres undersøgelser viste, at CPT hæmmer DNA- og RNA-syntesen (herunder ribosomalt RNA) og inducerer DNA-skader (Horwitz et al., 1971; Kessel, 1971; Abelson og Penman, 1972; Wu et al., 1971; Horwitz og Horwitz, 1973). Disse forskere observerede, at CPT er mest potent under S-fasen af cellecyklusen og forudsagde, at indgrebet under DNA-replikationen måske spiller en rolle i CPT-induceret celledød. Senere undersøgelser viste, at CPT stoppede cellecyklusen i både S- og G2-fasen, hvilket er årsagen til CPT-cytotoksicitet (Tsao et al., 1992; Goldwasser et al., 1996). I begyndelsen af 1980’erne blev en række ubeslægtede DNA-skadelige stoffer undersøgt klinisk til behandling af kræft og bakterielle infektioner. Undersøgelser afslørede to forskellige klasser af DNA-skadelige stoffer såsom quinolonantibiotika (cinoxacin, nalidixinsyre og ciprofloxacin) og podophyllotoxin-derivater (etoposid og teniposid), som viste sig at være DNA-skadelige. Begge klasser af lægemidler havde den samme virkningsmekanisme, nemlig hæmning af topoisomerase II (Top2), et enzym, der er aktivt i S-fasen, og som bidrager til DNA-replikationsfænomenet (Froelich-Ammon og Osheroff, 1995). Dr. Leroy F. Lius hold på John Hopkins testede i samarbejde med Smith Kline & French Laboratories i Philadelphia, om CPT også har en lignende aktivitet til at fremkalde celledød. Til deres overraskelse lykkedes det ikke for 125 µM CPT at hæmme Top2-afhængig DNA-spaltning. Da de imidlertid testede andre enzymer, der er forbundet med DNA-replikation, observerede de potent og dosisafhængig induktion af DNA-skader i tilstedeværelse af topoisomerase I (Top1) (Hsiang et al., 1985). Top1 ortologer findes i alle eukaryoter og synes at være et essentielt enzym under udviklingen i en lang række dyr. For eksempel er det dødeligt at slå Top1 ud i de tidlige udviklingsstadier for både Mus musculus (Morham et al., 1996) og Drosophila melanogaster (Zhang et al., 2000a,b). DNA Top1 er det enzym, der er ansvarligt for at afslappe supercoiled DNA under processen med DNA-replikation og transkription. Top1 kløver først superoprullet DNA for at indføre et enkeltstrenget brud, eller nick, i DNA’et og binder sig kovalent til den nickede 3′-ende af DNA’et og tillader den 5′-nickede streng at rotere rundt om den intakte streng på en kontrolleret måde. Efter rotationen religiøsiserer Top1 den nickede streng (Koster et al., 2005). Denne Top1-DNA-kompleksdannelse under DNA-replikation kaldes almindeligvis det “Top1-kovalente kompleks” på grund af den kovalente binding mellem Top1 og den nicked-streng (Pommier, 2006). CPT og CPT-analoger gør det nødvendigt at hæmme Top1-aktiviteten (Eng et al., 1988; Nitiss og Wang, 1988), hvilket resulterer i celledød. I cellen integrerer CPT sig selv i det kovalente Top1/DNA-kompleks og danner et ternært kompleks. Derfor er både Top1 og DNA nødvendige for aktiviteten, og CPT udviser ikke bindingsevne i fravær af hverken den ene eller den anden (Leteurtre et al., 1993). CPT binder sig til både Top1-enzymet og den intakte DNA-streng gennem hydrogenbinding og forhindrer både religiøsering af det nicked DNA og dissociation af Top1 fra DNA. Under replikationen fungerer dette CPT-ternære kompleks som en vejspærring for replikationsgaflen. Kollisionen mellem det ternære kompleks og replikationsgaflen forårsager skubspænding på den intakte DNA-streng, hvilket resulterer i brud og celledød. Det kendte mål for CPT og dets analoger er Top1-DNA-komplekset. Som nævnt ovenfor blev det imidlertid påvist, at CPT også påvirker protein-, RNA- og DNA-syntesen, hvilket tyder på, at CPT kan have andre cellulære mål. Den hæmmende aktivitet af CPT bekræftes yderligere, når gærceller med slettet Top1 bliver funktionelt immune over for CPT og dets analoger, og pattedyrs- eller humane kræftceller bliver resistente over for CPT’er, når Top1 er muteret (Gongora et al., 2011; Urasaki et al., 2001; Benedetti et al., 1993; Chang et al., 2002; Arakawa et al., 2013; Jensen et al., 2016). Overekspression af en mutant Top1 (Yanase et al., 1999) resulterer i øget aktivitet af Top1-forstærket CPT-følsomhed (Wu et al., 2014). Den mest omfattende undersøgte og dokumenterede virkningsmåde af CPT og dets analoger er hæmning af DNA. I den foreliggende gennemgang diskuteres imidlertid forskellige andre cellulære og molekylære mål for CPT, som også er ansvarlige for anticanceraktivitet.