Caco-2 Permeability Assay

Spørgsmål og svar om Caco-2 permeabilitet

Giv venligst en oversigt over Cyprotex’ Caco-2 Permeability Assay.

Caco-2 celler anvendes i vid udstrækning som en in vitro model til at forudsige absorption af lægemidler hos mennesker. Caco-2 cellelinjen stammer fra et humant kolorektalcarcinom, og når cellerne dyrkes, differentierer de spontant til monolag af polariserede enterocytter.

Cellerne udsås på multiwell-insert-plader og danner et konfluent monolag i løbet af 20 dage før forsøget. På dag 20 tilsættes teststoffet til den apikale side af membranen, og stoffets strømning gennem monolaget overvåges over en periode på 2 timer. For at undersøge udstrømning af lægemiddelstoffer er det også nødvendigt at undersøge transporten af stoffet fra det basolaterale rum til det apikale rum.

Permeabilitetskoefficienten (Papp) beregnes ud fra følgende ligning:

Hvor dQ/dt er stoffets permeationshastighed på tværs af cellerne, C0 er donorkoncentrationen på tidspunktet nul og A er arealet af cellemonolaget.

Hvordan fortolker jeg dataene fra Caco-2 permeabilitetsassayet?

Der er flere måder, hvorpå dataene fra Caco-2 permeabilitetsassayet kan anvendes. For det første kan stofferne rangordnes efter deres Papp-værdier. To referenceforbindelser, atenolol (passiv paracellulær transport) og propranolol (passiv transcellulær transport), screenes sammen med testforbindelserne. Atenolol og propranolol har en kendt absorption hos mennesker på henholdsvis 50 % og 90 %2,3 og kan anvendes som markører til at rangordne testforbindelserne. For det andet kan dataene anvendes sammen med andre in vitro-parametre til at forudsige den orale farmakokinetik af et stof in vivo ved hjælp af simuleringssoftwaren Cloe PK. For det tredje kan Caco-2-dataene bruges til at forudsige blod-hjernebarrierens (BBB) permeabilitet (figur 3).

Figur 3
Korrelation mellem Caco-2 afledt Pactive ((PappB-A – PappA-B)/2) og in situ BBB-permeationshastighed, logPS (permeabilitetsoverfladearealprodukt). Lægemidler, der vides at permeere BBB (koffein, imipramin, progesteron) har logPS >-2,0 (grønt skraveret område), mens lægemidler, der vides ikke at passere BBB (aldosteron, hydrocortison, cimetidin) har en logPS ≤-3,5 (lyserødt skraveret område).

Der er vist en regressionslinje, som viser en klar korrelation mellem Pactive og logPS for forbindelser, som ikke er udsat for et betydeligt niveau af udstrømningsaktivitet i Caco-2-cellerne, dvs, for forbindelser med en Pactive på < 5 × 10 -6 cm/s. Ved hjælp af denne korrelation kan Cyprotex’ Caco-2 assay anvendes til at vurdere BBB-potentialet for forbindelser med Pactive < 5 × 10 -6 cm/s.

Hvad er forholdet mellem Caco-2 permeabilitet og human intestinal absorption?

Forholdet mellem Caco-2 permeabilitet (ved brug af pH7,4 HBSS buffere i både det apikale og basolaterale kompartment) og human intestinal absorption er vist i figur 4. Denne korrelation er typisk for de sammenhænge, der er observeret i litteraturen for disse to parametre4. Det er vigtigt at bemærke, at dette plot påvirkes af nøjagtigheden af de intestinale absorptionsdata. De tarmabsorptionsværdier, der er anvendt i dette diagram, er taget fra Zhao et al. 20012. I dette dokument er den humane tarmabsorption blevet uddraget fra forskellige kilder og varierer betydeligt i kvalitet. Flere forbindelser er også kendt for at udvise dosisafhængig absorption (vist ved fejlbjælker på grafen).

Figur 4
Sammenhæng mellem Caco-2 permeabilitet og % human intestinal absorption.

Hvilke forskelle er der mellem PAMPA- og Caco-2 permeabilitetsassayet?

Caco-2 permeabilitetsscreeningen anses for at være mere repræsentativ for absorptionen hos mennesker in vivo end PAMPA (parallel artificial membrane permeability assay). PAMPA giver udelukkende et mål for passiv diffusion, mens Caco-2-modellen giver en bedre forudsigelse af absorptionen hos mennesker for stoffer, der udviser aktiv optagelse eller udstrømning eller passerer gennem membranen via den paracellulære vej. Oplysningerne fra begge assays, der anvendes sammen, kan være værdifulde til at identificere den grundlæggende årsag til dårlig absorption.

Hvordan måler jeg udstrømning af lægemiddelstoffer?

Der udføres en tovejs Caco-2 permeabilitetsassay, hvor transporten af stoffet måles i den apikale til basolaterale retning samt i den basolaterale til apikale retning. Resultatet rapporteres typisk som et udstrømningsforhold, dvs. Papp(B-A)/Papp(A-B). Hvis udstrømningsforholdet er større end to, tyder det på, at der er tale om udstrømning af lægemiddel. Talinolol, et kendt P-gp-substrat, screenes som et kontrolstof for at bekræfte, at cellerne udtrykker funktionelle udstrømningstransporterproteiner.

Hvordan ved man, om cellerne har dannet et konfluent monolag?

Transepithelial electric resistance (TEER) måling anvendes til at bestemme tight-junction dannelse mellem cellerne. Desuden saminkuberes lucifer gul, en membranintegritetsmarkør, med teststoffet i starten af forsøget. Hvis luciferguls Papp-værdi overstiger 1,0 × 10 -6 cm/s i en brønd, men det afledte Papp-resultat for teststoffet eller kontrolstoffet i den pågældende brønd kvalitativt svarer til det, der er bestemt i de(n) resterende replikatbrønd(er) (inden for lucifergultærsklen), kan cellemonolaget efter den ansvarlige forskers videnskabelige vurdering betragtes som acceptabelt. Hvis dette ikke er tilfældet, udelukkes resultatet fra det berørte monolag, og der indberettes et n=1-resultat, eller forbindelsen kan testes på ny. Hvis begge replikater er påvirket, screenes stoffet på ny. Hvis begge lucifer gul Papp-værdier for den samme forbindelse fejler ved to forskellige lejligheder, antages det, at forbindelsen enten udviser cytotoksiske virkninger mod Caco-2-cellerne eller iboende fluorescens.

Hvordan og hvorfor beregnes % genvinding?

Den % genvinding kan være nyttig ved fortolkningen af Caco-2-dataene. Hvis genfindingen er meget lav, kan det være tegn på problemer med dårlig opløselighed, binding af stoffet til pladen, metabolisme i Caco-2-cellerne eller ophobning af stoffet i cellemonolaget.